| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay for Detecting Direct and Indirect Protein – DNA Interactions in Magnaporthe oryzae
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Author:
Date:
2015-11-05
[Abstract] Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful technology for analyzing protein-DNA interactions in cells. Robust ChIP procedures have been established for investigating direct interactions between protein and DNA. However, detecting indirect protein-DNA interactions in vivo is challenging. Recently, we used ChIP to analyze an indirect protein-DNA interaction between a putative histone demethylase, MoJmjC, and the promoter of the superoxide dismutase 1-encoding gene MoSOD1 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae (M. oryzae) (Fernandez et al., ...
[摘要] 染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的技术，用于分析细胞中的蛋白质-DNA相互作用。已建立了稳健的ChIP程序用于研究蛋白质和DNA之间的直接相互作用。然而，在体内检测间接蛋白-DNA相互作用是具有挑战性的。最近，我们使用ChIP来分析推定的组蛋白去甲基化酶MoJmjC和在稻瘟病真菌Magnaporthe oryzae中超氧化物歧化酶1编码基因MoSOD1的启动子之间的间接蛋白质-DNA相互作用（ oryzae ）（Fernandez ，，2014）。我们用3x FLAG表位标记MoJmjC（Fernandez等人，2014），而不是更大和更常用的GFP表位，以减轻空间位阻。我们还采用了使用DSG和甲醛的两步交联策略，而不是更常用于分析直接蛋白质-DNA相互作用的一步甲醛交联方法，以便更好地捕获间接的MoJm - MoSOD1 DNA相互作用。此外，我们已经表明两步交联适用于GATA转录因子，Asd4及其同源结合位点之间的直接蛋白-DNA相互作用的ChIP分析（Marroquin-Guzman和Wilson，2015）。在这里，我们提供详细的协议的染色质免疫沉淀，与通用的两步交联，在M。 oryzae 。
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| Purification of the GfsA-3x FLAG Protein Expressed in Aspergillus nidulans
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Author:
Date:
2014-09-05
[Abstract] GfsA is a fungal β-galactofuranosyltransferase involved in the biosynthesis of O-glycan. To investigate the enzymatic functions of GfsA, we attempted to obtain a recombinant protein of this enzyme from two heterologous host organisms. However, GfsA could not be expressed as a recombinant protein in either Escherichia coli (E. coli) or Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Therefore, we decided to employ Aspergillus nidulans (A. nidulans) as the host organism, and produced a strain that expressed 3x FLAG-tagged GfsA using ...
[摘要] GfsA是涉及O - 聚糖的生物合成的真菌β-半乳糖呋喃糖基转移酶。 为了研究GfsA的酶功能，我们尝试从两种异源宿主生物体获得该酶的重组蛋白。 然而，GfsA不能在大肠杆菌（大肠杆菌）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表达为重组蛋白质（ cerevisiae ）。 因此，我们决定使用构巢曲霉（ A。nidulans ）作为宿主生物体，并产生使用染色体标签表达3×FLAG标记的GfsA的菌株。 为了证实其表达，从标记的菌株制备溶解的蛋白并用抗FLAG抗体分析。 表达3×FLAG标记的GfsA的菌株产生质量为约67kDa的功能性蛋白质。 该手稿中描述的方法允许纯化在A中表达的GfsA-3xFLAG蛋白。 构巢细胞。
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