| In vivo Priming of T Cells with in vitro Pulsed Dendritic Cells: Popliteal Lymph Node Assay
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] One-way mixed lymphocyte reaction (MLR) is a classic tool to measure how T cells react to external stimuli. However, MLR is an in vitro reaction system, which shows different response intensity compared with in vivo trails sometimes due to the lack of cytokines, tissue matrix and other immune response associated factors. The following popliteal lymph node assay (PLNA) protocol is designed to test the T cells antigen-specific reaction in vivo by using ovalbumin (OVA) specific reacted transgenic mouse OT-1 and OT-2.
[摘要] 单向混合淋巴细胞反应（MLR）是测量T细胞如何与外部刺激反应的经典工具。 然而，MLR是体外反应系统，其与体内踪迹相比显示出不同的反应强度，有时由于缺乏细胞因子，组织基质和其他免疫应答相关因素。 设计了以下po淋巴结测定（PLNA）方案，通过使用卵白蛋白（OVA）特异性反应的转基因小鼠OT-1和OT-2，体内测试T细胞抗原特异性反应。
【背景】在移植中，自身免疫和感染研究中，单向混合淋巴细胞反应（MLR）是评估T细胞增殖在抗原存在细胞（APC）或其他外部刺激反应中是否增加或抑制的有用参数。 这是一个典型的功能测试，它展示了T细胞如何受到免疫抑制药物（Hou et al。，2015; Zhang et al。，2015），阴性细胞或外来体疫苗（Ma）的测试试剂的影响 et al。，2016; Cai et al。，2017）。
然而，由于体外免疫反应系统，该系统具有一定的限制。 体内免疫反应受生物微环境的影响，如细胞因子，趋化因子，激素分泌，组织基质等未知生物因子。
在这里，po淋巴结测定（PLNA）被设计为体内工具，通过使用卵白蛋白（OVA）抗原特异性反应系统来测试增加或减少的免疫应答（Bhatt等，2014; Cai et al。，2017）。
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| A High-throughput Assay for mRNA Silencing in Primary Cortical Neurons in vitro with Oligonucleotide Therapeutics
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Primary neurons represent an ideal cellular system for the identification of therapeutic oligonucleotides for the treatment of neurodegenerative diseases. However, due to the sensitive nature of primary cells, the transfection of small interfering RNAs (siRNA) using classical methods is laborious and often shows low efficiency. Recent progress in oligonucleotide chemistry has enabled the development of stabilized and hydrophobically modified small interfering RNAs (hsiRNAs). This new class of oligonucleotide therapeutics shows extremely efficient self-delivery properties and supports potent ...
[摘要] 原代神经元是鉴定用于治疗神经变性疾病的治疗性寡核苷酸的理想细胞系统。然而，由于原代细胞的敏感性，使用经典方法转染小干扰RNA（siRNA）是费力的，并且通常显示低效率。寡核苷酸化学的最新进展使得稳定和疏水修饰的小干扰RNA（hsiRNA）的发展成为可能。这种新型的寡核苷酸治疗剂显示出非常有效的自我传递性质，并且在体外和体内支持有效和持久的效果。我们开发了高通量的体外测定法来鉴定和测试原代神经元培养物中的hsiRNA。为了简单，快速，准确地量化数百个hsiRNA的mRNA沉默，我们使用QuantiGene 2.0定量基因表达测定法。这种高通量，96孔板测定法可以直接从样品裂解液中定量mRNA水平。在这里，我们描述了一种制备96孔板格式的小鼠原代皮质神经元的短期培养物用于寡核苷酸治疗剂的高通量测试的方法。该方法支持在短短两周内测试hsiRNA文库和鉴定潜在的治疗方法。我们详细介绍了从初级神经元准备到数据分析的高通量测定工作流程的方法。该方法可以帮助鉴定用于治疗各种神经疾病的寡核苷酸治疗剂。
【背景】寡核苷酸治疗剂代表了通过沉默突变蛋白的表达，可以靶向任何遗传定义的病症的新一类药物。具体地，siRNA是负载于RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的双链寡核苷酸，并且可以在mRNA翻译之前使mRNA沉默。然而，未修饰的siRNA是不稳定的，并且不能在没有阳离子脂质制剂的帮助下进入细胞，其可能对原代细胞如神经元有毒性。在本协议中，我们使用自我递送，疏水修饰的siRNA（hsiRNA）进行mRNA沉默。最近在寡核苷酸化学方面的进展使得这些稳定的hsiRNA的设计促进了细胞内化，有效进入RISC以及有力击倒靶基因（Byrne等，2013; ...
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| Snapshots of the Signaling Complex DesK:DesR in Different Functional States Using Rational Mutagenesis and X-ray Crystallography
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] We have developed protocols to generate site-specific variants of the histidine-kinase DesK and its cognate response regulator DesR, conducive to trapping different signaling states of the proteins. Co-expression of both partners in E. coli, ensuring an excess of the regulator, was essential for soluble production of the DesK:DesR complexes and further purification. The 3D structures of the complex trapped in the phosphotransferase and in the phosphatase reaction steps, were solved by X-ray crystallography using molecular replacement. The solution was not trivial, and we found that in ...
[摘要] 我们已经开发了产生组氨酸激酶DesK及其同源反应调节物DesR的位点特异性变体的方案，有助于捕获蛋白质的不同信号状态。两个合作伙伴在大肠杆菌中的共表达，确保调节剂过量，对于DesK：DesR复合物的可溶性生产和进一步纯化是至关重要的。通过使用分子置换的X射线晶体学解决了捕获在磷酸转移酶和磷酸酶反应步骤中的复合物的3D结构。该解决方案不是微不足道的，我们发现在用作搜索探针的硅片生成的模型中，有助于将大部分复合物放置在不对称单元中。电子密度图就足够清楚了，可以进行人工建模，获得完整的原子模型。这些方法有助于解决细菌信号领域的主要挑战，即获得稳定的激酶：调节复合物，具有不同的构象状态，适用于高分辨率晶体学研究。
【背景】关于细菌信号复合物，特别是双组分系统（TCS）的结构信息仍然很少（Casino et al。，2009; Gao and Stock，2009）。 TCS包含几乎所有细菌中的感觉组氨酸激酶（HK）和响应调节剂（RR）配偶体，它们允许细胞感知环境并通过适应性反应相应地反应。尽管在信号传输中这种切换机制的重要性（Trajtenberg等，2016），结构信息对于采用不同功能状态的TCS复合体甚至更为有限。我们研究了DesK-DesR途径（de Mendoza，2014），一种来自枯草芽孢杆菌的TCS，其参与调节细胞膜组成以适应降低双层流动性的线索，如冷休克。 ...
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