| Isolation and Detection of the Chlorophyll Catabolite Hydroxylating Activity from Capsicum annuum Chromoplasts
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Hydroxylation of chlorophyll catabolites at the so-called C32 position (Hauenstein et al., 2016) is commonly found in all plant species analyzed to date. Here we describe an in vitro hydroxylation assay using Capsicum annuum chromoplast membranes as a source of the hydroxylating activity, which converts the substrate epi-pFCC (epi-primary Fluorescent Chlorophyll Catabolite) (Mühlecker et al., 2000) to epi-pFCC-OH.
[摘要] 所谓C32位置的叶绿素分解代谢物的羟基化（Hauenstein et al。，2016）通常在迄今为止分析的所有植物物种中发现。 在这里，我们描述了使用Capsicum annuum chromoplast membrane作为羟基化活性的来源的体外羟基化测定法，其将底物epi-pFCC（外显子荧光叶绿素Catabolite）（Mühlecker等，2000）转化为epi-pFCC-OH。
【背景】在叶片衰老和果实成熟期间，吸光叶绿素被降解成非荧光分解代谢物，以防止氧化损伤。叶绿素分解途径（PAO / phyllobilin途径）由几个酶催化的连续步骤组成，最终降解产物称为叶绿素，最终储存在液泡中（Kräutler，2016）。外源荧光叶绿素Cepolite（epi-pFCC）是第一种非光毒性中间体。在叶绿体中形成后，可以发生epi-pFCC的侧链修饰，其中大部分发生在叶绿体外。然而，这些修饰之一是由内部叶绿体包膜酶TIC55（铁氧还蛋白（Fd）依赖性非血红素加氧酶家族的成员）催化的C32位置（图1）的羟基化。 TIC55含有Rieske和单核铁结合结构域，并显示其需要Fd还原系统以及分子氧作为其羟基化活性。在这里我们描述了TIC55的体外酶测定法，其用于表征红辣椒色素体的表达pFCC羟基化酶活性。
图1.叶绿素分解途径的概述，突出了从epi-pFCC到epi-pFCC-OH的TIC55催化反应。 ...
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| Extraction of Chloroplast Proteins from Transiently Transformed Nicotiana benthamiana Leaves
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Author:
Date:
2014-09-20
[Abstract] This rapid protocol allows the extraction of chloroplast enriched proteins from Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) leaves that were transiently transformed to express an epitope tagged protein of interest. Thus, it can serve as a tool to study the chloroplastidic localization of the protein of interest when it is combined with western-blot analysis.
Agrobacterium-mediated transformation (Agroinfiltration, Romeis et al., 2001) is used to transiently express a protein carrying an epitope tag in tobacco leaves. Here, co-infiltration with an Agrobacterium ...
[摘要] 该快速方案允许从瞬时转化以表达感兴趣的表位标记蛋白的本氏烟草（本氏烟草）叶中提取富含叶绿体的蛋白。因此，当它与Western印迹分析结合时，它可以作为研究目标蛋白质的叶绿体定位的工具。使用土壤杆菌介导的转化（Agroinfiltration，Romeis等人，2001）瞬时表达在烟草叶中携带表位标签的蛋白质。在这里，与土壤传播的小麦花叶病毒携带19K的农杆菌菌株的共浸润抑制转录后基因沉默，并因此增加转化效率（Te等人，2005） 。转化的叶子的叶绿体分离基于Romeis等人（2001）的修改，包括细胞壁和膜的机械破坏，通过过滤去除未破坏的组织，通过Percoll层离心分离完整叶绿体。
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