| Detection of Pathogens and Ampicillin-resistance Genes Using Multiplex Padlock Probes
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Diagnostic assays for pathogen identification and characterization are limited either by the number of simultaneously detectable targets, which rely on multiplexing methods, or by time constraints due to cultivation-based techniques. We recently presented a 100-plex method for human pathogen characterization to identify 75 bacterial and fungal species as well as 33 clinically relevant β-lactamases (Barišić et al., 2016). By using 16S rRNA gene sequences as barcode elements in the padlock probes, and two different fluorescence channels for species and antibiotic resistance ...
[摘要] 用于病原体鉴定和表征的诊断测定法由依赖于多重方法的同时可检测目标的数量或由于基于培养的技术的时间限制来限制。 我们最近提出了一种用于人类病原体鉴定的100plex方法，以鉴定75种细菌和真菌物种以及33种临床相关β-内酰胺酶（Barišić等，2016）。 通过使用16S rRNA基因序列作为挂锁探针中的条形码元件，以及用于物种和抗生素抗性鉴定的两种不同的荧光通道，我们设法将需要的微阵列探针的数量减少一半。 因此，我们在这里介绍一个运行时间约为的测定方案。 8 h，检测限为105 cfu ml-1。 正确鉴定了89％的β-内酰胺酶和93.7％的物种。
【背景】β-内酰胺酶是一类提供抗β-内酰胺抗生素的抗生素抗性基因，其结构模拟D-丙氨酰-D-丙氨酸，细菌细胞壁的一个组分，从而抑制细菌细胞壁合成。 β-内酰胺酶能够水解β内酰胺抗生素β-内酰胺环的中心成分，并使其无效（Kong et al。，2010）。今天，描述了超过1000种β-内酰胺酶，并且存在巨大的潜在环境储层（Bush，2010; Brandt等，2017）。 ...
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| Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis
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Author:
Date:
2015-11-20
[Abstract] While telomerase is expressed in ~90% of primary human tumors, most somatic tissue cells except transiently proliferating stem-like cells do not have detectable telomerase activity (Shay and Wright, 1996; Shay and Wright, 2001). Telomeres progressively shorten with each cell division in normal cells, including proliferating stem-like cells, due to the end replication (lagging strand synthesis) problem and other causes such as oxidative damage, therefore all somatic cells have limited cell proliferation capacity (Hayflick limit) (Hayflick and Moorhead, 1961; Olovnikov, 1973). The progressive ...
[摘要] 虽然端粒酶在约90％的原发性人类肿瘤中表达，但除了瞬时增殖的干细胞样细胞之外，大多数体细胞组织细胞不具有可检测的端粒酶活性（Shay和Wright，1996; Shay和Wright，2001）。由于末端复制（滞后链合成）问题和其它原因例如氧化损伤，端粒在正常细胞中的每个细胞分裂（包括增殖的干细胞样细胞）逐渐缩短，因此所有体细胞具有有限的细胞增殖能力（Hayflick极限） （Hayflick和Moorhead，1961; Olovnikov，1973）。渐进性端粒缩短最终导致正常细胞中的生长停滞，其被称为复制衰老（Shay等人，1991）。一旦端粒酶在癌细胞中被激活，通过在染色体末端添加TTAGGG重复来稳定端粒长度，从而使细胞分裂无限延续（Shay和Wright，1996; Shay和Wright，2001）。因此，衰老和癌症之间的联系可以部分地解释端粒生物学。有许多快速和方便的方法来研究端粒生物学，例如端粒限制性片段（TRF），端粒重复扩增方案（Telomere Repeat Amplification Protocol， TRAP）（Mender and Shay，2015b）和端粒功能障碍诱导Foci（TIF）分析 ...
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| Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections
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Author:
Date:
2014-09-20
[Abstract] In situ hybridization and immunostaining are common techniques for localizing gene expression, the mRNA and protein respectively, within tissues. Both techniques can be applied to tissue sections to achieve similar goals, but in some cases, it is necessary to use them together. For example, complement C1q is a secreted protein complex that can target the innate immune response during inflammation. Complement has been found to be elevated early and before severe neurodegeneration in several disease models. Thus, complement may serve as an important marker for disease progression and ...
[摘要] 原位杂交和免疫染色是分别定位组织内基因表达，mRNA和蛋白质的常用技术。两种技术可以应用于组织切片以实现类似的目标，但是在一些情况下，有必要一起使用它们。例如，补体C1q是可以靶向炎症期间的先天免疫应答的分泌的蛋白复合物。已经发现补体在几种疾病模型中早期升高和严重神经变性之前升高。因此，补体可以作为疾病进展的重要标志物，并且可能有助于在某些条件下的病理学。由于补体是分泌的复合物，C1q的免疫染色不一定揭示产生补偿的位置。补体成分，C1q a，b或c mRNA的原位杂交是理想的标记组织中产生补体的细胞。原位杂交可以与细胞类型特异性免疫染色偶联以准确鉴定所涉及的细胞类型。蛋白质定位和mRNA定位一起可以揭示关于疾病组织内补体产生和补体靶细胞之间的关系的细节。在这里我们概述在同一组织切片上的组合原位杂交和免疫染色的步骤。这里概述的协议已设计用于检测小鼠脑神经元和小胶质细胞中的补体C1q。
这里提供了两种组合ISH/IH的方法。在第一个实施例中，C1q mRNA的原位杂交与使用Calbindin-D28K抗体的Purkinje神经元细胞体的荧光检测一起进行。在第二个实施例中，使用CD68抗体与小胶质细胞的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）一起进行C1q ...
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