| Mutant Huntingtin Secretion in Neuro2A Cells and Rat Primary Cortical Neurons
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Quantitative analysis of proteins secreted from the cells poses a challenge due to their low abundance and the interfering presence of a large amount of bovine serum albumin (BSA) in the cell culture media. We established assays for detection of mutant huntingtin (mHtt) secreted from Neuro2A cell line stably expressing mHtt and rat primary cortical neurons by Western blotting. Our protocol is based on reducing the amounts of BSA in the media while maintaining cell viability and secretory potential, and concentrating the media prior to analysis by means of ultrafiltration.
[摘要] 由细胞分泌的蛋白质的定量分析由于它们的丰度低和在细胞培养基中干扰大量牛血清白蛋白（BSA）的存在而提出挑战。 我们建立检测突变亨廷顿蛋白（mHtt）检测分泌Neuro2A细胞系稳定表达mHtt和大鼠原代皮层神经元蛋白质印迹。 我们的方案是基于降低培养基中BSA的量，同时保持细胞活力和分泌潜能，并在通过超滤分析之前浓缩培养基。
【背景】许多蛋白质通过各种分泌途径从细胞分泌到细胞外环境中。这些途径包括在ER-高尔基体 - 质膜途径之后的常规分泌途径（Lee等，2004）和多个非常规途径，例如溶酶体胞吐作用，穿过质膜的易位和外泌体以及胞外体释放（Zhang和Schekman，2013）。为了研究这些途径，经常需要分析培养细胞分泌的蛋白质进入培养基。蛋白质可以游离形式分泌，也可以与胞膜结构如胞外体和外泌体结合（Zhang and ...
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| In vitro Co-culture of Mesenchymal Stem Cells and Endothelial Colony Forming Cells
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] The discovery of endothelial colony forming cells (ECFCs) with robust self-renewal and de novo vessel formation potentials suggests that ECFCs can be an excellent cell source for cardiovascular diseases treatment through improving neovascularization in the ischemic tissues. However, their engraftment after transplantation resulted to be low. Previous studies showed mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) could improve the survival and capillary formation capacity of ECFCs in co-culture systems. In this article, we describe a protocol for in vitro co-culture of MSCs and ECFCs to prime ...
[摘要] 发现具有强大自我更新和从头血管形成潜力的内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）表明，ECFC可以通过改善缺血组织的新生血管形成，成为心血管疾病治疗的优良细胞来源。 然而，移植后的移植导致了低位移植。 以前的研究显示间充质干/基质细胞（MSC）可以改善共培养系统中ECFCs的存活和毛细管形成能力。 在这篇文章中，我们描述了体外协调MSCs和ECFCs共同培养ECFC以实现更好的移植。
【背景】内皮祖细胞（EPC）被定义为能够通过血管发生过程形成新血管的细胞群。 2004年，Ingram等人鉴定了来自人脐带血的称为“内皮细胞集落形成细胞（ECFC）”的离体培养物中的特异性高度增殖的EPC群体Ingram等人，2004），并且这些细胞最近被宣布代表EPCs（Medina等人，2017）。类似的群体也可以从具有等效血管化潜力和临床相关数量的人类胎盘组织中分离（Patel等人，2013; Shafiee等人，2015） ）。因此，ECFC移植已被提出作为缺血性疾病如心肌梗塞或关键性腿部缺血的治疗方法。然而，移植后的ECFCs植入物和血管生成潜力被证明是低的（Shafiee等人，2017; ...
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| Creating a RAW264.7 CRISPR-Cas9 Genome Wide Library
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 genome editing tools are used in mammalian cells to knock-out specific genes of interest to elucidate gene function. The CRISPR-Cas9 system requires that the mammalian cell expresses Cas9 endonuclease, guide RNA (gRNA) to lead the endonuclease to the gene of interest, and the PAM sequence that links the Cas9 to the gRNA. CRISPR-Cas9 genome wide libraries are used to screen the effect of each gene in the genome on the cellular phenotype of interest, in an unbiased high-throughput manner. In this protocol, we ...
[摘要] 细菌聚集的定期交织的短回文重复（CRISPR）-Cas9基因组编辑工具用于哺乳动物细胞敲除感兴趣的特定基因以阐明基因功能。 CRISPR-Cas9系统要求哺乳动物细胞表达Cas9核酸内切酶，引导RNA（gRNA）引导内切核酸酶到目的基因，以及连接Cas9与gRNA的PAM序列。使用CRISPR-Cas9基因组宽的文库以无偏倚的高通量方式筛选基因组中每个基因对感兴趣的细胞表型的影响。在本协议中，我们描述了我们在转化的鼠巨噬细胞细胞系（RAW264.7）中创建CRISPR-Cas9基因组文库的方法。我们已经使用该文库来鉴定胱天蛋白酶-11细胞死亡途径中的新型介质（Napier等人，2016）;然而，该文库可用于筛选特定基因在多种鼠巨噬细胞通路中的重要性。
背景 历史上，使用RNA干扰（RNAi）或源自敲除小鼠的细胞，了解特定基因对真核细胞中感兴趣的表型的贡献是可能的。然而，在过去几年中，新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9已经允许在真核细胞内容易且有效地产生敲除细胞系和全基因组筛选。 CRISPR-Cas9基因组范围的筛选扩大了哺乳动物遗传学的工具箱和新型蛋白质的鉴定及其对特定表型的贡献。使用这种方法，研究人员已经能够鉴定参与肿瘤生长的新基因（Chen等人，2015; Kiessling等人，2016; Steinhart ...
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