| CRISPR/Cas9 Editing of the Bacillus subtilis Genome
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] A fundamental procedure for most modern biologists is the genetic manipulation of the organism under study. Although many different methods for editing bacterial genomes have been used in laboratories for decades, the adaptation of CRISPR/Cas9 technology to bacterial genetics has allowed researchers to manipulate bacterial genomes with unparalleled facility. CRISPR/Cas9 has allowed for genome edits to be more precise, while also increasing the efficiency of transferring mutations into a variety of genetic backgrounds. As a result, the advantages are realized in tractable organisms and ...
[摘要] 大多数现代生物学家的基本过程是研究生物体的遗传操作。尽管许多不同的方法用于编辑细菌基因组已经在实验室中使用了数十年，但CRISPR / Cas9技术对细菌遗传学的适应使得研究人员能够以无与伦比的设施来操纵细菌基因组。 CRISPR / Cas9允许基因组编辑更精确，同时也提高将突变转移到各种遗传背景的效率。因此，在遗传操作难以处理的易处理生物和生物体中实现了这些优点。在这里，我们描述了我们编辑枯草芽孢杆菌细菌基因组的方法。我们的方法是高效的，导致精确，无标记的突变。此外，在产生编辑质粒之后，可以将突变快速导入几个遗传背景，大大增加可进行遗传分析的速度。
枯草芽孢杆菌是高度易处理的革兰氏阳性菌。遗传研究适用于使用多种载体通过同源重组快速有效地引入突变。尽管有许多不同的方法来引入B突变。 subtilis，每种方法都有其局限性。一种简单而简单的方法，用于在B中进行突变。枯草芽孢杆菌是基因破坏，其中将质粒整合到感兴趣的基因内（Vagner等人，1998）。主要的局限性包括：1）扰乱操纵子的极地作用的潜力; 2）引进和保留外来DNA; 3）一旦使用抗生素耐药性盒，如果在其他突变的背景下研究给定的突变，则研究者必须使用不同的盒;和4）该方法限于靶向整个基因，并且不能产生更精确的点突变。 ...
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| Preparation of Purified Gram-positive Bacterial Cell Wall and Detection in Placenta and Fetal Tissues
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Cell wall is a complex biopolymer on the surface of all Gram-positive bacteria. During infection, cell wall is recognized by the innate immune receptor Toll-like receptor 2 causing intense inflammation and tissue damage. In animal models, cell wall traffics from the blood stream to many organs in the body, including brain, heart, placenta and fetus. This protocol describes how to prepare purified cell wall from Streptococcus pneumoniae, detect its distribution in animal tissues, and study the tissue response using the placenta and fetal brain as examples.
[摘要] 细胞壁是所有革兰氏阳性菌表面上的复杂生物聚合物。在感染期间，细胞壁被先天免疫受体Toll样受体2识别，引起强烈的炎症和组织损伤。在动物模型中，从血流到体内许多器官（包括脑，心脏，胎盘和胎儿）的细胞壁运输。该协议描述了如何从肺炎链球菌制备纯化的细胞壁，检测其在动物组织中的分布，并且使用胎盘和胎脑作为实例研究组织反应。
关键词： 细胞壁，肽聚糖，细菌炎症，神经增殖，胎儿神经发生，胎盘运输，Toll样受体2配体，肺炎链球菌
/strong>宿主对感染的反应涉及许多细菌组分的识别，包括细胞壁（CW），一种形成所有革兰氏阳性细菌表面的复合大分子。革兰氏阳性细菌的CW由肽聚糖和磷壁酸的共价网络形成。肺炎链球菌是肺炎，败血症和脑膜炎的主要原因，已经成为研究对包括CW在内的革兰氏阳性细菌感染的先天免疫反应的重要模式生物体。 当肺炎链球菌（肺炎球菌）感染时，CW成分在生长期或抗生素诱导的死亡期间从细菌释放，它在血流中循环并穿过细胞屏障，包括胎盘和血脑屏障。 CW组分具有等于或大于完整细菌的炎性活性（Tuomanen等人，1985a和1985b）。 ...
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| Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement
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Author:
Date:
2016-08-05
[Abstract] The mitochondrial pathway of apoptosis involves a complex interplay between dozens of proteins and lipids, and is also dependent on the shape and size of mitochondria. The use of cellular models in past studies has not been ideal for investigating how the complex multi-factor interplay regulates the molecular mechanisms of mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). Isolated systems have proven to be a paradigm to deconstruct MOMP into individual steps and to study the behavior of each subset of MOMP regulators. In particular, isolated mitochondria are key to in vitro ...
[摘要] 凋亡的线粒体途径涉及数十种蛋白质和脂质之间的复杂相互作用，并且还依赖于线粒体的形状和大小。在过去的研究中使用细胞模型不是理想的调查如何复杂的多因素相互作用调节线粒体外膜透化（MOMP）的分子机制。分离系统已被证明是将MOMP解构成各个步骤并研究每个子集的MOMP调节剂的行为的范例。特别地，分离的线粒体是BCL-2家族蛋白的体外研究的关键，BCL-2家族蛋白是直接控制凋亡的线粒体途径的促存活和促凋亡蛋白的复合家族（Renault > et al 。，2013）。
在这个协议，我们描述三个补充程序用于实时调查使用孤立的线粒体MOMP调节器的影响。第一种方法是"肝线粒体分离"，其中从小鼠中分离肝脏以获得线粒体。 "用JC-1和大小分级分离的线粒体标记"是描述标记，按大小分级并标准化线粒体亚群的方法的第二个方法。最后，"实时MOMP测量"协议允许在孤立的线粒体上实时跟踪MOMP。上述程序用于在体外确定线粒体膜形状在分离的细胞和分离的线粒体水平上的作用（Renault等人，2015）。
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