Secretion of Adipsin as an Assay to Measure Flux from the Endoplasmic Reticulum (ER)
|
Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In this protocol we describe a quantitative biochemical assay to assess the efficiency of endoplasmic reticulum (ER) to Golgi protein transport in adipocytes (Bruno et al., 2016). The assay takes advantage of the fact that adipocytes secrete various bioactive proteins, known as adipokines. As a measure of ER to Golgi flux we determine the rate of bulk secretion of the adipokine adipsin post washout of Brefeldin A (BFA) treatment using immunoblotting. Because BFA treatment results in an accumulation of adipsin in the ER, the exit of adipsin from the ER upon BFA washout is synchronized ...
[摘要] 在该方案中,我们描述了一种定量生化测定法来评估内质网(ER)对脂肪细胞中高尔基体蛋白质转运的效率(Bruno等,2016)。 该测定法利用脂肪细胞分泌各种生物活性蛋白质(称为脂肪因子)的事实。 作为对高尔基体通量的ER的测量,我们使用免疫印迹法确定了使用Brefeldin A(BFA)处理的脂肪因子adipsin后消失的体积分泌速率。 因为BFA治疗导致ER中Adipsin的积累,所以在BFA洗脱时,Adipsin从ER的出口在细胞和实验条件下同步。 因此,使用这种简单的测定法可以稳健地确定扰动,如敲低蛋白质,是否对高尔基蛋白转运的ER有影响。 【背景】新合成的蛋白质通过分泌途径从细胞分泌到细胞膜(PM)中。分泌路线包括从ER到高尔基体的运输,穿过高尔基体堆叠,以及从高尔基网络(TGN)到PM的运动。这些运输步骤中的每一个提供用于调节分泌物的节点。虽然大多数细胞能够分泌蛋白质,但某些特定的细胞类型是特异性蛋白质的专业秘密。脂肪细胞,例如,分泌激素,称为脂肪因子,影响各种器官的能量代谢。为了更好地了解脂肪因子分泌的分子基础,我们开发了一种测定方法,研究了从ER到脂肪细胞的高尔基体的脂肪因子,一种脂肪因子的转运。研究ER到高尔基体运输的传统和常用的方法是监测从ER融合到GFP(VSVG-GFP)的温度敏感性水泡性口炎病毒G蛋白ts045的出口(Presley等,1997)。使用adipsin分泌测定法研究脂肪细胞中的高铁运输的优点是监测来自ER的内源性蛋白质的通量,而不是异位表达的报道蛋白。 ...
|
|
Infection of Nicotiana benthamiana Plants with Potato Virus X (PVX)
|
Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Potato Virus X (PVX) is the type member of Potexvirus genus, a group of plant viruses with a positive-strand RNA genome (~6.4 kb). PVX is able to establish compatible infections in Nicotiana benthamiana, a commonly used host in plant virology, leading to mild symptoms, such as chlorotic mosaic and mottling. PVX has been widely used as a viral vector for more than two decades (Chapman et al., 1992; Baulcombe et al., 1995; Aguilar et al., 2015). It provides a feasible means for the systemic expression in plants of heterologous proteins, such ...
[摘要] 马铃薯病毒X(PVX)是Potexvirus属(一组具有正链RNA基因组(〜6.4kb)的植物病毒)的类型成员。 PVX能够在烟草烟草(Nicotiana benthamiana)中建立相容的感染,这是常用于植物病毒学的宿主,导致轻度症状,如褪色马赛克和斑驳。 PVX已经被广泛用作病毒载体二十多年(Chapman等人,1992; Baulcombe等人,1995; Aguilar等人。它为异源蛋白质植物中的全身表达提供了可行的手段,例如无毒性因子,具有药理学性质的蛋白质,等等(Hammond-Kosack等人, 1995; Gleba等人,2014),并且还作为通过病毒诱导的基因沉默(VACS)(Lacomme和Chapman,2008)帮助解释植物中基因功能的工具。摩擦(A)和农用过滤(B)的两种不同的方案,即允许PVX在N中的有效乘法和传播。本文详细描述本文。摩擦方法需要先前感染的液体,并且通过诱导对叶组织的机械损伤来实现感染,从而允许病毒颗粒穿透植物表面。农杆菌过滤需要先前修饰的农杆菌携带并将PVX序列递送到植物细胞中。将土壤杆菌生长直至饱和,并用注射器将其浸入植物组织中建立感染。这两种方法中的任何一种都可以成功应用,选择应主要基于材料和时间的可用性,但建议在使用嵌合病毒时使用农杆菌滤过。
背景 ...
|
|
An in vitro Transcription/translation System for Detection of Protein Interaction
|
Author:
Date:
2016-05-05
[Abstract] Studying protein-protein interaction is crucial to understand the fundamental processes of molecular biology. High-throughput screening, such as immunoprecipitation followed by proteomic analysis, allows for the identification of numerous candidate partners that might interact with a selected protein. However, experimental validation of protein-protein interaction requires conventional cloning and recombinant protein expression/purification, which are complicated and labor-intensive techniques. Here, we demonstrate an efficient experimental pipeline for verifying protein-protein interactions ...
[摘要] 研究蛋白质 - 蛋白质相互作用对于理解分子生物学的基本过程是至关重要的。高通量筛选,如免疫沉淀,然后蛋白质组分析,允许鉴定可能与选择的蛋白质相互作用的许多候选伙伴。然而,蛋白质 - 蛋白质相互作用的实验验证需要常规克隆和重组蛋白表达/纯化,这是复杂和劳动密集型技术。在这里,我们演示了一个有效的实验管道,用于验证使用Odontoglossum环斑病毒(ORSV)衣壳蛋白(CP)和宿主CP结合蛋白的例子的诱饵蛋白之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。这些候选CP结合蛋白通过高通量蛋白质组学和转录组学方法进行鉴定。使用TOPO克隆策略,将每个候选基因克隆到表达载体中,用于在体外转录/翻译系统的单个步骤中表达His标记的重组蛋白。这种表达的His标记的候选物可以在共免疫沉淀(co-IP)测定中用作CP诱饵蛋白的猎物,以验证它们的物理相互作用。不需要传统的蛋白质表达和纯化,该管道简化了验证过程,并为高通量蛋白质 - 蛋白质相互作用研究提供了解决方案。
|
|