| Reverse Phase-high-performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) Analysis of Globin Chains from Human Erythroid Cells
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] β-hemoglobinopathies are severe genetic disorders characterized either by the abnormal synthesis of the adult β-globin chains of the hemoglobin (Hb) tetramer (βS-globin chains) in sickle cell disease (SCD) or by the reduced β-globin production in β-thalassemia. The identification and quantification of globin chains are crucial for the diagnosis of these diseases and for testing new therapeutic approaches aimed at correcting the β-hemoglobinopathy phenotype. Conventional techniques to detect the different Hb molecules include cellulose-acetate electrophoresis ...
[摘要] [摘要] β-血红蛋白病是严重的遗传性疾病，其特征在于或者由血红蛋白的β成人珠蛋白链的合成异常血红蛋白（Hb）四聚体（β小号球蛋白链）的镰状细胞病（SCD）或通过减少β- β地中海贫血中球蛋白的产生。珠蛋白链的鉴定和定量对于这些疾病的诊断和测试旨在纠正β-血红蛋白病表型的新治疗方法至关重要。检测不同Hb分子的常规技术包括醋酸纤维素电泳（CEA）， 毛细管电泳（CE），等电聚焦（IEF）和阳离子交换HPLC（CE-HPLC）。但是，这些方法无法区分不同的球蛋白链，无法精确确定它们的相对表达。我们已经建立了高分辨率和可再现的反相HPLC（RP-HPLC），以基于其不同的疏水特性来检测和鉴定组成血红蛋白四聚体的球蛋白链。RP-HPLC流动相由产生疏水环境的乙腈（ACN）和三氟乙酸（TFA）组成，后者破坏Hb四聚体中的血红素基团并释放出单独的球蛋白链。将含Hb的裂解物上样到Aeris TM 3.6 µm WIDEPORE C4 200ÅLC色谱柱上，随着时间的流逝疏水性梯度的增加，可以进行珠蛋白链分离。球蛋白链的相对量在220nm的波长（λ）下测量。该协议被设计用于（i）从人外周血获得的红血细胞（红细胞），（II）评价红细胞珠蛋白链在体外从造血干细胞分化的/祖细胞（HSPC的），和（iii）脉冲串形成单位- è ...
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| Uptake Assays in Xenopus laevis Oocytes Using Liquid Chromatography-mass Spectrometry to Detect Transport Activity
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] Xenopus laevis oocytes are a widely used model system for characterization of heterologously expressed secondary active transporters. Historically, researchers have relied on detecting transport activity by measuring accumulation of radiolabeled substrates by scintillation counting or of fluorescently labelled substrates by spectrofluorometric quantification. These techniques are, however, limited to substrates that are available as radiolabeled isotopes or to when the substrate is fluorescent. This prompted us to develop a transport assay where we could in principle detect transport ...
[摘要] 非洲爪蟾卵母细胞是用于表征异源表达的第二活性转运蛋白的广泛使用的模型系统。历史上，研究人员依靠通过闪烁计数或荧光标记的底物通过分光荧光定量测量放射性标记底物的积累来检测运输活动。然而，这些技术仅限于可用作放射性标记的同位素的底物或当底物是荧光时。这促使我们开发了一种运输测定法，我们可以原则上检测任何有机代谢物的转运活性，无论其作为放射性标记的同位素或荧光性质如何。
在这个协议中，我们描述了X的使用。卵母细胞作为表达次要活性转运蛋白的异源宿主，以及如何进行摄取测定，然后通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）检测和定量运输的代谢物。我们已经成功地使用这种方法来鉴定和表征称为硫代葡萄糖苷和氰基葡糖苷的植物防御代谢物的转运蛋白（Jørgensen等人，2017），然而该方法可用于表征任何转运蛋白底物可以通过LC-MS检测。
【背景】来自非洲爪蟾蛙（Xenopus laevis）的卵母细胞是用于异源表达和表征膜蛋白（即，转运蛋白和通道）的完整表达系统。 X。卵母细胞表达少量内源性膜蛋白，具有低的背景转运活性。此外，来自植物的次要活性转运蛋白（Boorer等人，1992; Theodoulou和Miller，1995; Nour-Eldin等人，2006），动物（Sumikawa 1981）; ...
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| Protein Isolation from Plasma Membrane, Digestion and Processing for Strong Cation Exchange Fractionation
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Plasma membrane (PM) proteins play crucial roles in diverse biological processes. But their low abundance, alkalinity and hydrophobicity make their isolation a difficult task. This protocol describes an efficient method for PM proteins isolation, digestion and fractionation so that they can be well prepared for mass spectrometry analysis.
[摘要] 血浆膜（PM）蛋白在不同生物过程中起关键作用。但是，他们的低丰度，碱度和疏水性使其隔离成为一项艰巨的任务。该方案描述了PM蛋白分离，消化和分级的有效方法，以便它们可以很好地准备用于质谱分析。
背景 血浆膜（PM）蛋白参与不同的生物学过程，包括信号转导，离子运输和膜运输，是细胞与环境交流中的第一反应者。它们具有从物种，细胞类型和发育阶段变化的复杂组成（Alexandersson等人，2008）。用质谱（MS）全面揭示其组分和表达特征对发育生物学非常重要。然而，它们的疏水性和低丰度对于蛋白质组学分析是一个很大的挑战（Wu和Yates，2003）。通常使用像正常表面活性剂，有机溶剂和尿素这样的添加剂来改善PM蛋白的溶解度，但它们会降低蛋白酶的活性并在MS分析过程中产生离子抑制（Zhang，2015）。 Rapi Gest SF是一种新型酸不稳定的阴离子表面活性剂，其结构和功能上与SDS类似，但不抑制低浓度（0.1％w / v）下的常见内肽酶活性。因此，Rapi 用于增溶PM蛋白的Gest SF不仅可以通过暴露裂解位点促进它们的消化，而且还容易被强酸淬灭并通过离心去除，使表面活性剂不影响MS鉴定（Yu 等人，2003）。通过Rapi Gest ...
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