| Production of Guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR Using Ribozymes and RNA Polymerase II Promoters
|
|
Author:
Date:
2017-02-20
[Abstract] CRISPR/Cas9-mediated genome editing relies on a guide RNA (gRNA) molecule to generate sequence-specific DNA cleavage, which is a prerequisite for gene editing. Here we establish a method that enables production of gRNAs from any promoters, in any organisms, and in vitro (Gao and Zhao, 2014). This method also makes it feasible to conduct tissue/cell specific gene editing.
[摘要] CRISPR / Cas9介导的基因组编辑依赖于指导性RNA（gRNA）分子来产生序列特异性DNA切割，这是基因编辑的前提条件。在这里，我们建立了一种能够从任何启动子，任何生物体内和体外生产gRNA的方法（Gao和Zhao，2014）。该方法也可以进行组织/细胞特异性基因编辑。
背景 几乎所有报道的CRISPR介导的基因编辑病例都使用小核RNA如U6和U3 snRNA启动子的启动子来驱动体内生产gRNAs（Cong等人，2013; Mali等人，2013）。然而，U6和U3启动子有几个主要的局限性：1）它们是组成型活性的，不可调谐的; 2）它们缺乏细胞/组织特异性; 3）它们在许多生物体中没有明确定义; 4）U6需要G和U3需要A用于转录起始，从而限制目标选择; 5）由于缺乏商业RNA聚合酶III，它们不适合体外转录。不幸的是，构成大部分特征启动子的RNA聚合酶II启动子不能直接用于体内的gRNA生产，原因如下：1）RNA聚合酶II启动子的主要转录物经历广泛的加工如5'-端封端，3'末端聚腺苷酸化和拼接出内含子。一些修饰可能使设计的gRNA无功能。 2）将成熟的RNA分子转运到细胞质中;因此它们与位于细胞核中的预期目标物理分离。这就是为什么使用U6和U3 ...
|
|
|
| In vitro Reconstitution Assay of miRNA Biogenesis by Arabidopsis DCL1
|
|
Author:
Date:
2015-04-20
[Abstract] microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs, regulating most if not all, biological processes in eukaryotic organisms. miRNAs are initially processed from primary transcripts (pri-miRNAs) to produce miRNA precursors (pre-miRNAs), that are further processed into miRNA and its complementary strands (miRNA/*). In Arabidopsis, and possibly other plants, the processing from pri-miRNAs to pre-miRNAs and from pre-miRNAs to miRNA/* are both implemented through Dicer-like 1 (DCL1) complexes. Recently, we demonstrated isolation of DCL1 complexes of unprecedented quality from in planta. We ...
[摘要] 微小RNA（miRNA）是小的非编码RNA，其调节真核生物中的大多数（如果不是全部）生物过程。 miRNA最初从初级转录物（pri-miRNA）加工以产生miRNA前体（前-miRNA），其进一步加工成miRNA及其互补链（miRNA/*）。在拟南芥和可能的其他植物中，从pri-miRNA到pre-miRNA和从pre-miRNA到miRNA/*的加工都通过Dicer样1（DCL1）复合物实现。最近，我们证明了从植物中以前的质量的DCL1复合物的分离。我们进一步成功地重建了能够完全重现体内 miRNA生物发生的DCL1切割测定。在这里我们提供DCL1重建测定的详细协议。该方案包括三个主要部分（图1）：1）pri-miRNA和pre-miRNA转录物的制备（方法A-C）; 2）通过免疫沉淀（IP）纯化来自本塞姆氏烟草（本塞姆氏烟草）的重组拟南芥DCL1机器（程序D和E）;和3）使用分离的DCL1复合物（步骤F）在放射性同位素标记的pri-miRNA或pre-miRNA的体外处理。这是我们的愿望，协议是RNAi社区研究机械问题或开发RNA沉默技术的强大工具。
|
|
|
| Cross-linked RNA Immunoprecipitation
|
|
Author:
Date:
2013-03-05
[Abstract] This method is for the immunoprecipitation of Flag-Tagged RNA binding proteins from mammalian cell lines and isolation of the bound RNAs for analysis by quantitative real-time PCR. The RNA binding protein of interest should be tagged with the M2 Flag-tag and expressed in the mammalian cell line of interest (Knuckles et al., 2012). However, specific antibodies for the protein of interest can be used in conjunction with Sepharose G-beads.
[摘要] 该方法用于来自哺乳动物细胞系的Flag-标记的RNA结合蛋白的免疫沉淀和分离结合的RNA，用于通过定量实时PCR分析。 感兴趣的RNA结合蛋白应该用M2 Flag标签标记并在感兴趣的哺乳动物细胞系中表达（Knuckles等人，2012）。 然而，感兴趣的蛋白质的特异性抗体可以与Sepharose G-珠结合使用。
|
|
|