| High Throughput NPY-Venus and Serotonin Secretion Assays for Regulated Exocytosis in Neuroendocrine Cells
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Here we describe two assays to measure dense core vesicle (DCV) exocytosis-mediated cargo secretion in neuroendocrine cells. To conduct siRNA screens for novel genes in regulated DCV exocytosis, we developed a plate reader-based secretion assay using DCV cargo, NPY-Venus, and an orthogonal 3H-serotonin secretion assay. The NPY-Venus secretion assay was successfully used for a high throughput siRNA screen, and the serotonin secretion assay was used to validate hits identified from the screen (Sorensen, 2017; Zhang et al., 2017).
[摘要] 在这里我们描述了两种测定方法来测量神经内分泌细胞中的致密核心囊泡（DCV）胞吐作用介导的货物分泌。 为了在受调控的DCV胞吐作用中对新基因进行siRNA筛选，我们开发了使用DCV货物，NPY-金星以及正交3H-血清素分泌测定的基于读板器的分泌测定法。 NPY-金星分泌测定成功地用于高通量siRNA筛选，并且使用血清素分泌测定来验证从筛选中鉴定的命中（Sorensen，2017; Zhang等人，2017）。
【背景】致密核心囊泡（DCV）胞吐作用介导内分泌和神经内分泌细胞分泌蛋白质，肽和小分子。当蛋白质和肽激素被内质网上的核糖体合成时，蛋白质和肽激素进入分泌途径，并在跨高尔基网络（TGN）（Borgonovo等人，2006; Bowman等， >等人，2009）。小分子物质，如5-羟色胺，直接被胞质单胺转运蛋白（VMATs）从细胞质直接吸收到DCV的内腔（Sudhof，2004）。在非刺激条件下，货物分子被储存在靠近质膜的DCV内。当细胞接受增加细胞质Ca ...
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| Mandibular Explant Assay for Investigating Extrinsic Stimuli on Bone and Cartilage Development
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] A major issue in developmental biology is to determine how embryonic tissues respond to molecular signals in a timely manner and given the position-restricted instructions during morphogenesis, of which Meckel’s cartilage is a classical example. The ex-vivo explant model is a practical and convenient system that allows investigation of bone and cartilage responses to specific stimuli under a controlled manner that closely mimics the in vivo conditions. In this protocol, the explant model was applied to test whether Meckel’s cartilage and surrounding tissues are responsive to ...
[摘要] 发育生物学中的一个主要问题是确定胚胎组织如何及时响应分子信号，并且在形态发生期间给予位置限制指示，其中Meckel软骨是一个经典的例子。 体外外植体模型是一种实用且便利的系统，其允许以受控的方式调查对特定刺激的骨和软骨反应，所述方式严格模拟体内条件。 在这个协议中，外植模型被用来测试Meckel的软骨和周围组织是否对内皮素1（Edn1）信号分子有反应，以及是否会拯救基因突变的表型。 该系统允许在添加到外植体中的外源性化合物的浓度，关于测量下颌骨发育的时间点以及施用外源分子和致畸剂的方法方面进行高度的操作。
【背景】颅面畸形是人类最常见的先天性出生缺陷（Miettinen等人，1999）。许多这些畸形发生在面部形态发生期间，这是一个复杂的多步骤过程，其中颅神经嵴细胞迁移到咽弓以产生许多面部结构（Jin等人，2011）。
特定基因内的两种变异以及基因 - 基因相互作用都可能导致颅面变形。 IRF6基因突变导致头面部外胚层和上皮细胞的形成，导致唇裂，腭裂和下颌畸形。与 IRF6 相比， TWIST1 基因调节胚胎发育期间的神经管闭合和颅骨发育期间的颅缝融合。 TWIST1 ...
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| Bacterial Survival in Dictyostelium
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Author:
Regin Rønn, Xiuli Hao, Freja Lüthje, Nadezhda A. German, Xuanji Li, Fuyi Huang, Javan Kisaka, David Huffman, Hend A. Alwathnani, Yong-Guan Zhu and Christopher Rensing,
Date:
2017-07-05
[Abstract] We performed an assay to test the ability of different E. coli strains to survive inside amoebal cells after ingestion. In the assay we incubated bacteria together with cells of Dictyostelium discoideum for six hours. After co-incubation most of the uningested bacteria were removed by centrifugation and the remaining uningested bacteria were killed by gentamicin. Gentamicin is used because it does not penetrate into eukaryotic cells allowing the ingested bacteria to survive the antibiotic treatment, whereas bacteria outside the amoebal cells are killed.
[摘要] 我们进行了一个测试来测试不同E的能力。 大肠杆菌菌株在摄入后在变形细胞内存活。 在测定中，我们将细菌与迪氏底盘藻细胞一起培养6小时。 共培养后，通过离心除去大部分未染色的细菌，剩余的未染色细菌被庆大霉素杀死。 使用庆大霉素，因为它不会渗透到真核细胞中，允许摄取的细菌在抗生素治疗中存活，而在变形细胞外的细菌被杀死。
【背景】细菌已经发展了几种不同的策略来避免或抵抗原生动物的捕食（Rønn等人，2012）。减少摄入机会，如增加细胞大小，聚集，生物膜形成和增加游泳速度的机制有充分的记录（Matz和Kjelleberg，2005;Rønn等人，2012），而机制允许细菌摄入后原生动物食物空泡中抵抗消化较少研究（龚等人，2016）。在这里，我们描述了一种方法来研究细菌菌株在通过社会变形虫的盘根盘菌摄入后存活的能力。我们使用这种测定法来研究铜是否耐药。大肠杆菌摄入后的生存机会比没有铜抗性的细菌更高（郝等，2016）。我们研究了铜电阻，因为已知巨噬细胞是在脊椎动物的免疫系统中具有重要作用的吞噬细胞，使用铜来杀死吞噬细胞中的细菌（Hodgkinson和Petris，2012）。我们假设这种杀伤机制最初是在多细胞生命发生之前自由生存的原生动物中发生的，因此铜抗性可能是保护细菌免受原生动物捕食的一个因素。
该测定法是用于评估巨噬细胞杀死细菌的能力的庆大霉素保护测定的修饰（参见例如，，Kaneko等人，2016），并且它利用庆大霉素不能渗入真核细胞。在原始测定中，在两个时间点确定巨噬细胞中的内化细菌细胞的数量。首先，将巨噬细胞与细菌一起培养给定的时间段，并且在这种共培养之后，去除未经检测的细菌并估计内化细菌的数量。巨噬细胞在没有细胞外细菌的情况下进行第二次测量，以使其消化内源性细菌。这两个估计之间的比率是细菌存活率的量度。 ...
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