| Lentiviral Knockdown of Transcription Factor STAT1 in Peromyscus leucopus to Assess Its Role in the Restriction of Tick-borne Flaviviruses
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Cellular infection with tick-borne flaviviruses (TBFVs) results in activation of the interferon (IFN) signaling pathway and subsequent upregulation of numerous genes termed IFN stimulated genes (ISGs) (Schoggins et al., 2011). Many ISGs function to prevent virus pathogenesis by acting in a broad or specific manner through protein-protein interactions (Duggal and Emerman, 2012). The potency of the IFN signaling response determines the outcome of TBFV infection (Best, 2017; Carletti et al., 2017). Interestingly, data from our lab show that TBFV replication is significantly ...
[摘要] 蜱传黄热病病毒（TBFV）的细胞感染导致干扰素（IFN）信号传导途径的激活和随后称为IFN刺激基因（ISG）（Schoggins等人，2011）的众多基因的上调。许多ISG通过蛋白质 - 蛋白质相互作用以广泛或特定的方式起作用来防止病毒发病（Duggal和Emerman，2012）。 IFN信号反应的效力决定了TBFV感染的结果（Best，2016; Carletti等人，2017）。有趣的是，我们实验室的数据显示TBFV复制在储库物种Peromyscus leucopus的细胞中显着受到限制，从而表明有效的抗病毒应答（Izuogu等人，2017）。我们评估干扰素信号对抗性的相对贡献。通过敲低IFN反应途径中的主要转录因子来抑制白血病。信号转导和转录激活因子1（STAT1）是专门针对在P。 leucopus细胞通过shRNA技术。我们进一步测试了基因敲低对细胞对IFN反应和限制病毒复制的能力的影响;结果表明当STAT1表达被改变时，leucopus细胞对IFN刺激的反应降低，并且对TBFV复制显着更敏感。
【背景】IFN信号是抵抗侵入宿主细胞的黄病毒的第一道防线（Robertson等人，2009; Lazear和Diamond，2015）。通过模式识别受体（PRR）检测与病毒颗粒相关的分子标记，然后通过转录因子引发下游信号从细胞释放1型IFN（Kawai ...
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| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay for Detecting Direct and Indirect Protein – DNA Interactions in Magnaporthe oryzae
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Author:
Date:
2015-11-05
[Abstract] Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful technology for analyzing protein-DNA interactions in cells. Robust ChIP procedures have been established for investigating direct interactions between protein and DNA. However, detecting indirect protein-DNA interactions in vivo is challenging. Recently, we used ChIP to analyze an indirect protein-DNA interaction between a putative histone demethylase, MoJmjC, and the promoter of the superoxide dismutase 1-encoding gene MoSOD1 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae (M. oryzae) (Fernandez et al., ...
[摘要] 染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的技术，用于分析细胞中的蛋白质-DNA相互作用。已建立了稳健的ChIP程序用于研究蛋白质和DNA之间的直接相互作用。然而，在体内检测间接蛋白-DNA相互作用是具有挑战性的。最近，我们使用ChIP来分析推定的组蛋白去甲基化酶MoJmjC和在稻瘟病真菌Magnaporthe oryzae中超氧化物歧化酶1编码基因MoSOD1的启动子之间的间接蛋白质-DNA相互作用（ oryzae ）（Fernandez ，，2014）。我们用3x FLAG表位标记MoJmjC（Fernandez等人，2014），而不是更大和更常用的GFP表位，以减轻空间位阻。我们还采用了使用DSG和甲醛的两步交联策略，而不是更常用于分析直接蛋白质-DNA相互作用的一步甲醛交联方法，以便更好地捕获间接的MoJm - MoSOD1 DNA相互作用。此外，我们已经表明两步交联适用于GATA转录因子，Asd4及其同源结合位点之间的直接蛋白-DNA相互作用的ChIP分析（Marroquin-Guzman和Wilson，2015）。在这里，我们提供详细的协议的染色质免疫沉淀，与通用的两步交联，在M。 oryzae 。
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| Measurement of Junctional Protein Dynamics Using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
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Author:
Date:
2013-10-20
[Abstract] Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) (Lippincott-Schwartz et al., 2003; Reits and Neefjes, 2001) was employed to determine dynamic properties of proteins localized at the ephitelial zonula adherens (ZA) (Kovacs et al., 2011; Otani et al., 2006). The proteins of interest were expressed in cells using a knockdown and reconstitution approach in which endogenous proteins were depleted by RNA interference (RNAi) and replaced by expression of an RNAi-resistant gene fused to GFP (Priya et al., 2013; Smutny et al., 2010; Smutny et al., ...
[摘要] 使用光漂白后的荧光恢复（FRAP）（Lippincott-Schwartz等人，2003; Reits和Neefjes，2001）来确定位于Ephitelial zonula adherens（ZA）处的蛋白质的动力学性质（Kovacs < et="" al。，2011;="" otani="" et="" al。，2006）。使用敲除和重建方法在细胞中表达感兴趣的蛋白质，其中内源蛋白质被rna干扰（rnai）耗尽，并被与gfp融合的rnai抗性基因的表达代替（priya等人。="">，2013; Smutny等人，2010; Smutny等人，2011; Vitriol等人，2007）。通过选择与内源水平相当的GFP标记蛋白的表达水平，我们最小化了由于克服了直接影响蛋白质动力学的调节机制的瞬时过表达人工产物（Goodson等人，2010）。使用这种方法，使用共聚焦显微镜检查，在对应于ZA的小区域中对连接的E-钙粘蛋白-GFP或GFP-Ect2进行FRAP分析（Priya等人，2013; Ratheesh等人。，2012; Gomez等人，2005; ...
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