| Dual Fluorescence Cytometry Assay to Assess Cellular Protein Levels
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Expression levels of cellular proteins can be affected by various perturbations, such as genetic knockout of interactors, drug treatments or cell stress. To specifically measure the effects on protein levels post-synthesis under different experimental conditions, it is important to compensate for transcriptional and other upstream changes. Here, we provide a protocol for a dual-fluorescence flowcytometry-based assay to determine protein levels. The protein of interest is genetically linked to enhanced GFP (eGFP) followed by a viral 2A self-cleaving peptide sequence and mCherry. As a result, ...
[摘要] [摘要 ] 表达水平的细胞蛋白质可受各种扰动，如基因敲除交互件，药物治疗小号或细胞压力。具体测量对蛋白质水平合成后在不同的实验条件，重要的是要补偿对于转录等上游的变化在这里，我们提供了一个协议为双- 荧光流。流式细胞仪为基础的检测，以确定蛋白质水平目的蛋白是遗传关联增强GFP（EGFP 其次是病毒2A自身切割肽）序列和mCherry结果，报告子构建体的翻译会导致来自同一mRNA模板的两个荧光蛋白产物，这使得能够进行明确的蛋白表达分析，并对整个样品进行归一化处理。
背景 ] 合成和维护的Cellu 拉尔在p- Roteins取决于多进程，从转录调节，处理和降解mRNA中翻译，折叠，本地化，翻译后修饰和蛋白质降解（沃格尔而且马科特，2012） 。具体研究的。在蛋白水平合成后的细胞扰动的影响，这一点很重要，以弥补变异上游步骤蛋白表达在这里，我们提供了一个协议的双- 荧光流术为基础的检测，以确定蛋白质水平处于稳定状态如前所述（Itakura 等人，2016; Chitwood 等人，2018; Ngo 等人，2019）。目的蛋白在基因上与增强的GFP（eGFP ）融合，随后是病毒2A自切割肽序列和一个第二种荧光蛋白，mCherry （图1），由于在2A s时核糖体跳过了肽键，融合构建体的翻译产生了两种蛋白质产物，其比例为1：1。ite：与eGFP 和mCherry ...
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| Preparation of a Bacteriophage T4-based Prokaryotic-eukaryotic Hybrid Viral Vector for Delivery of Large Cargos of Genes and Proteins into Human Cells
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] A viral vector that can safely and efficiently deliver large and diverse molecular cargos into cells is the holy grail of curing many human diseases. Adeno-associated virus (AAV) has been extensively used but has a very small capacity. The prokaryotic virus T4 has a large capacity but lacks natural mechanisms to enter mammalian cells. Here, we created a hybrid vector by combining T4 and AAV into one nanoparticle that possesses the advantages of both. The small 25 nm AAV particles are attached to the large 120 nm x 86 nm T4 head through avidin-biotin cross-bridges using the phage decoration ...
[摘要] [摘要 ] 一种病毒载体，可以安全有效地将大量多样的分子货物运送到细胞中 是治愈许多人类疾病的圣杯。腺伴随病毒（AAV）已被广泛使用，但容量很小。T4原核病毒容量大，但缺乏进入哺乳动物细胞的天然机制。在这里，我们通过将T4和AAV结合到一个具有两者优势的纳米颗粒中，创建了一种杂交载体。使用噬菌体修饰蛋白Soc（小的外衣壳蛋白）和Hoc（高度抗原化的外衣壳蛋白），通过亲和素-生物素交叉桥将25 nm的AAV小颗粒连接到120 nm x 86 nm的大T4头上。因此，AAV凭借其固有的进入多种类型人体细胞的自然能力，可以“背负”于T4衣壳上，从而有效地充当了“驱动器”，以运送与T4头相关的大型货物。这种独特的T4-AAV杂交载体方法可为将来开发新型疗法铺平道路。
[背景 ] 已经有新的和有效的递送载体能够运输基因和蛋白质的大货物进入人类细胞，以刺激生产治疗性生物分子的和/或修复的细胞和遗传缺陷的迫切需要。这样的载体将允许将快速出现的技术（例如CRISPR，CAR T细胞等）转化为用于大规模应用以及个性化医学的疗法（Stewart 等，2016）。
将具有不同特性的纳米粒子组装到杂化复合物中是开发新型功能材料的有力策略，因为这些杂化复合物显示出集体和协作的属性，其中某些属性可能与单个粒子所显示的属性不同（Ghosh 等人，2012； ...
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| Method for CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Candida albicans
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Candida albicans is the most prevalent and important human fungal pathogen. The advent of CRISPR as a means of gene editing has greatly facilitated genetic analysis in C. albicans. Here, we describe a detailed step-by-step procedure to construct and analyze C. albicans deletion mutants. This protocol uses plasmids that allow simple ligation of synthetic duplex 23mer guide oligodeoxynucleotides for high copy gRNA expression in C. albicans strains that express codon-optimized Cas9. This protocol allows isolation and characterization of deletion strains within ...
[摘要] 白色念珠菌是最普遍和最重要的人类真菌病原体。 CRISPR作为基因编辑手段的出现极大地促进了 C中的遗传分析。白色假丝酵母。 在这里，我们描述一个详细的分步过程来构建和分析 C。 白色念珠菌缺失突变体。 该协议使用质粒，允许合成的双链体23mer引导寡聚脱氧核苷酸在高拷贝gRNA表达的简单连接。 表达密码子优化的Cas9的白色念珠菌菌株。 该协议允许在9天内分离和鉴定缺失菌株。
【背景】℃。白色念珠菌是一种难以处理遗传的有机体。由于它通常作为不容易进行有性生殖的二倍体存在，所以纯合隐性突变需要对每个基因座进行连续修饰。克隆间规则间隔短回文重复（CRISPR）突变的发展和应用。白色念珠菌促进遗传操作，因为它允许两个等位基因同时突变（Vyas et al。，2015; Min et al。，2016; Ng and Dean，2017 ）。 CRISPR基因编辑涉及将RNA引导的核酸酶募集至邻近NGG原型间隔子邻接基序（PAM）的互补靶位点（Jinek等人，2012; Cong等人， 2013年;马里等人，2013年）。 CRISPR相关（Cas）核酸酶通过与结合Cas9的激活CRISPR RNA（tracrRNA）相关的指导RNA之间的互补碱基配对以高特异性进行靶向（Gasiunas等人， ...
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