| Purification of Cytosolic Phospholipase A2α C2-domain after Expression in Soluble Form in Escherichia coli
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Previous expression/purification strategies for cytosolic phospholipase A2α C2-domain in Escherichia coli have relied on refolded protein recovered from inclusion bodies and sometimes containing C-terminal Cys139Ala and Cys141Ser substitutions to eliminate potential refolding complications induced by Cys residues. The protocol presented herein describes an effective method for the expression of cytosolic phospholipase A2α C2-domain in soluble form in E. coli and subsequent purification to homogeneity. This protocol, which utilizes a cleavable 6xHis-SUMO tag, has recently been used ...
[摘要] [摘要]胞质磷脂酶A上一页表达/纯化策略2 α在C2结构域Ê scherichia大肠杆菌一直依赖于重折叠蛋白从包涵体回收和有时含有C末端Cys139Ala和Cys141Ser取代，以消除由感应电势再折叠的并发症的Cys残基。本文所介绍的协议描述了用于胞浆型磷脂酶A的表达的有效方法2 αC2结构域以可溶形式在大肠杆菌和随后的纯化至均一。此协议，它利用可切割的6xHis-SUMO标记，最近被用于洞察磷脂的结构基础-通过胞浆型磷脂酶A的C2结构域胆碱识别2 α（平野。等人，2019 ）
[背景技术]磷脂酶A 2 （PLA 2）是一个多样化酶超家族的成员水解的SN -2酰基酯键的磷酸甘油酯（史密斯，1989;丹尼斯。等人，2011; Mouchlis和Dennis，2019 ）。胞质PLA 2 α（与cPLA 2 α），第IV族哺乳动物PLA2家族成员，优选从在细胞内的Ca磷酸甘油酯释放花生四烯酸2+ -浓度依赖性（克拉克等人清水;，1991等人，2006; Leslie等，2010; Vasquez等，2018; Astudillo等，2019 ）。花生四烯酸通过与cPLA产生2 α用作促炎症类花生酸的前体，包括某些前列腺素和白三烯。因此，与cPLA 2 ...
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| Extracellular RNA Isolation from Biofilm Matrix of Pseudomonas aeruginosa
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Most bacteria in natural ecosystems form biofilms-a bacterial community, surrounded by a polymer matrix that consists mostly of exopolysaccharides, proteins, and nucleic acids. Extracellular RNA as a matrix component is involved in biofilm formation-the fact that was confirmed by direct detection of extracellular RNA in the biofilm matrix, and by an interruption of the biofilm's structure with RNases. Number of protocols describing isolation of RNA from biofilm matrix are limited and usually involve uncommon equipment and reagents. Here we describe simple method for extracellular RNA ...
[摘要] [摘要]自然生态系统中的大多数细菌形成生物膜 –一个细菌群落，周围环绕着聚合物基质，该基质主要由胞外多糖，蛋白质和核酸组成。细胞外RNA作为基质成分参与生物膜的形成，这一事实已通过直接检测生物膜基质中的细胞外RNA以及通过RNase破坏生物膜结构而得到证实。。描述从生物膜基质中分离RNA的方案数量有限，通常涉及不常见的设备和试剂。在这里，我们描述了使用基本的实验室试剂和设备从生物膜基质分离细胞外RNA的简单方法。该方案的关键步骤包括用高离子浓度的NaCl溶液分离基质和细菌细胞，用LiCl沉淀RNA，并选择使用廉价的色谱柱进行质粒DNA分离，而不是使用专门的RNA试剂盒进行纯化。所描述的方案允许在不到一天的时间内（不包括生物膜生长的时间）分离适用于进一步的分子生物学程序（例如测序，RT-PCR和克隆）的细胞外RNA。
[背景]生物膜基质可抵抗不同的影响（抗菌药物，消毒剂，机械力），并为协调协调不同过程创造了环境（Svenningsen，2018年）。RNA存在于细胞外生物膜基质中，并形成RNA-DNA的主要交联弹性共聚物（Seviour等，2019）。用核糖核酸酶处理生物膜导致生物膜质量的重大损失，并强调了RNA对于维持生物膜完整性的重要性（Lee等人，2019）。同时，RNA在生物膜基质中的来源和作用仍未得到很好的研究。
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| Protocol for the Isolation and Super-resolution dSTORM Imaging of RyR2 in Cardiac Myocytes
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Since its inception, super-resolution microscopy has played an increasingly important role in the discovery and characterization of nanoscale biological structure. dSTORM, which is one of the most commonly applied methods, relies on stochastic photoswitching of fluorophores to recreate a super-resolution image. The cardiac field has particularly benefitted from the application of this technique, as it has enabled sub-diffraction-limit visualization of calcium release units (CRUs) and the fundamental structures that trigger contraction. Acquisition of such images requires careful, reproducible ...
[摘要] 自成立以来，超分辨率显微镜在纳米级生物结构的发现和表征中发挥着越来越重要的作用。 dSTORM是最常用的方法之一，它依赖于荧光团的随机光切换来重建超分辨率图像。心脏场特别受益于该技术的应用，因为它已经实现了钙释放单元（CRU）的子衍射极限可视化和触发收缩的基本结构。获取这些图像需要仔细，可重复的样品制备，并且在实验期间保持一致的成像条件。在这里，我们提出了生产心肌细胞中Ca 2 + 释放通道Ryanodine Receptor type-2（RyR2）的dSTORM图像的标准化方法。所提出的方案特别关注涉及原发性心肌细胞分离，样品制备和成像的步骤，其中提供了针对实验溶液和显微镜设置的细节。本讨论之后是各种分析技术的概述，以识别集群和CRU中的RyR2组织
【背景】近年来，超分辨率显微镜的普及率迅速提高。已经描述了各种超分辨率技术，其使光学分辨率远低于光的衍射极限，在某些情况下接近可通过电子显微镜获得的光学分辨率。总之，这些技术的出现导致了纳米级生物结构，结构域和蛋白质相互作用的新研究的爆炸式增长。一种流行的超分辨率技术是直接随机光学显微镜（dSTORM），与标准共聚焦显微镜相比，它将相对简单的样品处理的优势与分辨率提高了约10倍（van de Linde ...
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