| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
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| Single-probe RNA FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Quantitative profiling of mRNA expression is an important part of understanding the state of a cell. The technique of RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) involves targeting an RNA transcript with a set of 40 complementary fluorescently labeled DNA oligonucleotide probes. However, there are many circumstances such as transcripts shorter than 200 nt, splicing variations, or alternate initiation sites that create transcripts that would be indistinguishable to a set of multiple probes. To this end we adapted the standard FISH protocol to allow the use of a single probe with a ...
[摘要] mRNA表达的定量分析是理解细胞状态的重要部分。 RNA荧光原位杂交（FISH）技术涉及用一组40个互补的荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向RNA转录物。 然而，许多情况下，如转录本短于200 nt，剪接变异，或创建转录本的替代起始位点，这些转录本与一组多重探针无法区分。 为此，我们调整了标准FISH方案，以允许使用具有单个荧光团的单个探针来量化出芽酵母细胞内的转录物的量。 除了允许定量短转录本或转录本的短特征之外，该技术还降低了执行FISH的成本。
【背景】通过单分子荧光原位杂交（smFISH）可以精确定量单细胞转录谱。 该过程通过用多个荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向单个mRNA分子给出了良好的噪声信号（Raj和Tyagi，2010）。 使用该方案，不能检测到长度短于200个核苷酸的mRNA。 然而，在大多数实验中，绝对转录本拷贝数比相对拷贝数少。 为了检测短的转录物或序列，可以使用短的单个DNA寡核苷酸探针。 当使用单个荧光团计数mRNA时，单个探针的检测效率大于50％（Wadsworth等人，2017）。
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| Nuclear Transformation of Chlamydomonas reinhardtii by Electroporation
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is an important model organism for studying photosynthesis, acclimation to abiotic stress, cilia biology, and many other biological processes. Many molecular biology tools exist for interrogating gene function including the ability to easily transform the nuclear genome of Chlamydomonas. While technical advances such as TALENs, ZFNs and CRISPR are making it easier to precisely edit the nuclear genome, the efficiency of such methods in Chlamydomonas is at present very low. In contrast, random insertion by nuclear ...
[摘要] 单细胞绿藻莱茵衣藻是研究光合作用，适应非生物胁迫，纤毛生物学和许多其他生物过程的重要模式生物。 许多分子生物学工具用于询问基因功能，包括轻松转化衣藻的核基因组的能力。 虽然TALENs，ZFNs和CRISPR等技术进步正在使精确编辑核基因组变得更加容易，但此类方法在衣原体中的效率目前非常低。 相反，通过核转变随机插入往往是一个更有效的过程。 该协议描述了通过电穿孔转化衣原体核基因组的方法。 该协议需要至少3天的工作，并通常导致1-2周内出现小菌落。
【背景】众多的分子，遗传和基因组资源使得莱茵衣藻（以下简称衣衣属）成为研究各种生物过程的优秀模式生物。已经开发了许多技术来改变衣藻核，叶绿体和线粒体，包括粒子轰击（Boynton等，1988），玻璃珠转化（Kindle，1990）和电穿孔（Shimogawara等人，1998）。核衣壳菌可通过将衣藻暴露于物理或化学诱变剂（例如紫外线或甲磺酸乙酯）而产生，但通常通过随机插入诱变转基因DNA而获得。由于衣藻核转化的同源重组效率非常低（Zorin等人，2009; Jinkerson和Jonikas，2015），转化的DNA通常整合到核基因组随机位点。存在许多用于随后鉴定异位DNA的插入位点的技术，包括经典遗传作图（Rymarquis等人，2005），TAIL-PCR（Dent等人 ...
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