| Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Optogenetic methods are now widespread in neuroscience research. Here we present a detailed surgical procedure to inject adeno-associated viruses and implant optic fiber cannulas in the dorsal raphe nucleus (DRN) of living mice. Combined with transgenic mouse lines, this protocol allows specific targeting of serotonin-producing neurons in the brain. It includes fixing a mouse in a stereotaxic frame, performing a craniotomy, virus injection and fiber implantation. Animals can be later used in behavioral experiments, combined with optogenetic manipulations (Dugué et al., 2014; Correia et ...
[摘要] 光神学研究现在广泛存在。在这里，我们提供一个详细的外科手术，以注射腺相关病毒和植入光纤插管在活的小鼠背侧核心（DRN）。结合转基因小鼠系，该方案允许在脑中特异性靶向产生5-羟色胺的神经元。它包括将鼠标固定在立体定位框架中，执行开颅手术，病毒注射和纤维植入。动物可以随后用于行为实验，结合光遗传操作（Dugué等，2014; Correia等，2017）或监测神经元活动（Matias等，2017）。
所描述的程序是深部脑区域的光生和光纤测光实验中的基本步骤。它针对DRN中的血清素神经元进行了优化，但可以应用于任何其他细胞类型和脑区域。当使用表达功能相关水平的光遗传工具或报告物系的转基因小鼠品系时，可以跳过病毒注射步骤，并将该方案降低到插管植入程序。
【背景】随着光遗传学方法的出现，使用光纤和遗传编码的探针来操纵或监测大脑活动已迅速扩大。光致发光工具对于研究神经调节系统特别有用，因为它们通常以位于深部脑区域的神经元簇为特征，对多个脑区域进行长期和广泛的预测。先前已经针对脑中的不同区域描述了病毒注射和纤维插管植入（例如，腹侧被盖区域[Tsai等人，2009]，基因座（Carter等，2010））。
鉴于其深部解剖学位置在导管和上矢状窦下方，针对背侧核心核（DRN，血清素投影到前脑的主要来源）可能是复杂的。使用标准的外科手术可能导致大量出血和低成功率，导致样本量较小（Ranade和Mainen ...
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| Isolation and Quantification of Plant Extracellular Vesicles
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication by transporting proteins and RNA. While plant cells secrete EVs, they have only recently been isolated and questions regarding their biogenesis, release, uptake and function remain unanswered. Here, we present a detailed protocol for isolating EVs from the apoplastic wash of Arabidopsis thaliana leaves. The isolated EVs can be quantified using a fluorometric dye to assess total membrane content.
[摘要] 细胞外囊泡（EVs）通过传递蛋白质和RNA在细胞间通讯中发挥重要作用。 虽然植物细胞分泌电动汽车，但是它们最近才被孤立，并且关于它们的生物发生，释放，摄取和功能的问题仍然没有得到回答。 在这里，我们提出了一个详细的方案，用于从拟南芥叶片的脱水洗涤中分离EV。 可以使用荧光染料定量分离的EV，以评估总膜含量。
【背景】细胞外囊泡（EVs）是介导蛋白质，脂质和遗传物质的细胞与细胞转移的膜结合结构。由于哺乳动物EVs转运RNA和调节免疫反应的能力，对哺乳动物EV的兴趣已经增长。哺乳动物EV通常被分离用于从培养细胞的培养基中研究，以及生物流体的增长列表（Colombo等，2014）。植物电动车也被认为在免疫反应中起作用，但比较缺乏（An et al。，2007; Davis et al。，2016）。这在很大程度上归因于没有孤立的方法。
虽然植物EVs自1967年以来一直被观察到，使用透射电子显微镜，但直到2009年才开发出分离方法（Halperin和Jensen，1967）。 ...
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| A Co-culture Model for Determining the Target Specificity of the de novo Generated Retinal Ganglion Cells
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In glaucoma, the output neurons of the retina, the retinal ganglion cells (RGCs), progressively degenerate, leading to irreversible blindness (Ahram et al., 2015). The ex vivo stem cell method to replace degenerated RGCs remains a potentially viable approach (Levin et al., 2004). However, the success of the approach depends upon the ability of the de novo generated RGCs to connect over the long distance with specific targets in the central visual pathway. Here, we describe a protocol to examine the target specificity of the de novo generated RGCs ...
[摘要] 在青光眼中，视网膜的输出神经元，视网膜神经节细胞（RGC）逐渐退化，导致不可逆的失明（Ahram等人，2015）。 替代退化RGCs的离体干细胞方法仍然是潜在可行的方法（Levin等人，2004）。 然而，该方法的成功取决于生成RGC的远程连接与中心视觉通路中特定目标的能力。 在这里，我们描述了一种协议，用于使用共培养方法来检查产生RG的产生RGCs的靶特异性，其中RGCs神经突被允许在特异性（上丘（SC））和非特异性 （下丘，IC）构造目标。
青光眼是全球不可逆失明的最常见原因之一（Tham等人，2014）。其特征在于RGC的进行性退化，视网膜的主要输出神经元，其与大脑连接用于视觉感知。不幸的是，目前尚无治疗RGCs变性的治疗方法。无论是外科手术，药理学还是神经保护，管理方法都不能扭转退行性变化（Danesh-Meyer，2011）。鉴于这种棘手的情况，干细胞治疗已经成为替代死亡RGCs的潜在可行方法。这种方法的成功需要：1）功能性和非致瘤性RGC与多能干细胞的定向分化，以及2）产生RGC的新生靶标特异性。我们的实验室最近展示了一种化学定义的方法，通过重述发育机制（Teotia等人，2016），允许RGCs从胚胎干（ES）/诱导的多能干细胞（iPS）细胞中的定向分化。所得的RGC是稳定的，功能性的和非致瘤性的。然而，远离干细胞在青光眼RGC变性中的生物细胞的成功取决于它们的轴突在中心视觉途径中找到适当靶标的能力。移植后，RGC的轴突必须在视网膜内导航，作为视神经退出，决定在视交叉处交叉或不交叉，并达到建立视网膜连接的具体目标。我们已经证明ES ...
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