| Screening Method for CRISPR/Cas9 Inhibition of a Human DNA Virus: Herpes Simplex Virus
|
|
Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] The efficiency of cleavage of individual CRISPR/Cas9-sgRNAs remains difficult to predict based on the CRISPR target sequence alone. Different intracellular environments (dependent on cell type or cell cycle state for example) may affect sgRNA efficiency by altering accessibility of genomic DNA through DNA modifications such as epigenetic marks and DNA-binding proteins (e.g., histones) as well as alteration of the chromatin state of genomic DNA within the nucleus.
We recently reported a multi-step screening method for the identification of efficient sgRNAs targeting the ...
[摘要] [摘要 ] 单独基于CRISPR靶序列仍难以预测单个CRISPR / Cas9-sgRNA的切割效率。不同的细胞内环境（例如，取决于细胞类型或细胞周期状态）可能会通过DNA修饰（例如表观遗传标记和DNA结合蛋白（例如组蛋白））和染色质状态的改变来改变基因组DNA的可及性，从而影响sgRNA效率。核内基因组DNA的标记。
我们recen TLY 报道的多步骤方法筛选用于有效sgRNAs靶向的识别的单纯疱疹病毒（HSV-1）的基因组，并报告为在潜对裂解病毒相抑制CRISPR-Cas9的差动机构。该协议中详述的筛选平台允许在无细胞系统中以及在病毒靶细胞（例如人包皮成纤维细胞）的背景下逐步测试切割效率，然后对CRISPR / sgRNA的作用进行功能测试病毒蛋白的表达，复制，和再活化。该策略可以容易地应用于其他靶细胞，例如多能干细胞衍生的人感觉神经元或其他人DNA病毒。
背景 ] 单纯疱疹病毒（HSV）是的一种嗜神经性DNA病毒疱疹病毒科家族引起终身和无法治愈感染在大多数人群的，并可能导致显著发病率和死亡率（Liesegang环等人，1989; Roizman 等人。，2013） ...
|
|
|
| Random Insertional Mutagenesis of a Serotype 2 Dengue Virus Clone
|
|
Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Protein tagging is a powerful method of investigating protein function. However, modifying positive-strand RNA virus proteins in the context of viral infection can be particularly difficult as their compact genomes and multifunctional proteins mean even small changes can inactivate or attenuate the virus. Although targeted approaches to functionally tag viral proteins have been successful, these approaches are time consuming and inefficient. A strategy that has been successfully applied to several RNA viruses is whole-genome transposon insertional mutagenesis. A library of viral genomes, each ...
[摘要] 蛋白质标记是研究蛋白质功能的有效方法。然而，在病毒感染的情况下修饰正链RNA病毒蛋白可能特别困难，因为它们的紧密基因组和多功能蛋白意味着即使很小的变化也可以使病毒失活或减弱。尽管功能性标记病毒蛋白的靶向方法已经成功，但这些方法耗时且效率低。已经成功应用于几种RNA病毒的策略是全基因组转座子插入诱变。通过细胞培养中的传代选择病毒基因组文库，每个文库含有单个随机放置的小插入，并且可以使用下一代测序（NGS）鉴定插入位点。在这里，我们描述了用于登革病毒16681株血清型2的转座子诱变的方案。含有短随机放置插入物的突变登革病毒文库通过哺乳动物细胞传代，插入由有活力后代的NGS定位。该方案分为四个阶段：登革热cDNA克隆的转座子诱变，病毒基因组转染到允许细胞，分离病毒后代基因组和测序文库制备。
【背景】 ...
|
|
|
| Single and Multiplexed Gene Editing in Ustilago maydis Using CRISPR-Cas9
|
|
Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] The smut fungus Ustilago maydis is an established model organism for elucidating how biotrophic pathogens colonize plants and how gene families contribute to virulence. Here we describe a step by step protocol for the generation of CRISPR plasmids for single and multiplexed gene editing in U. maydis. Furthermore, we describe the necessary steps required for generating edited clonal populations, losing the Cas9 containing plasmid, and for selecting the desired clones.
[摘要] 黑穗病真菌 Ustilago maydis 是一种既定的模式生物，用于阐明生物营养病原体如何在植物中定殖以及基因家族如何对毒力作出贡献。 在这里，我们描述了用于生成用于 U中单个和多重基因编辑的CRISPR质粒的逐步方案。玉米小斑病。 此外，我们描述了产生编辑的克隆群体，丢失含有Cas9的质粒以及选择所需克隆所需的必要步骤。
【背景】担子菌真菌 U. maydis 是一种模式生物，能够在DNA修复和同源重组，交配，性发育，次级代谢，丝状生长，RNA转运和毒力等主题中获得重要发现（Holliday，2004; Steinberg，2007; Bakkeren et al。，2008; Holloman et al。，2008; Lanver et al。，2017; Niessing et al。 ，2018年）。 Ú。 maydis 是一种生物营养的植物病原体，可引起玉米的黑穗病。作为大群黑穗病真菌的典型成员，其性发育与其定殖植物的能力密切相关。 U的受欢迎程度。 maydis 作为一种模式生物存在于其短暂的致病生命周期中，该生命周期在不到两周内完成，其可用于正向和反向遗传，包括建立自我复制的质粒（Tsukuda 等。，1988），能够在没有交配的情况下引起疾病的致病性病毒株的开发和可用的注释良好的基因组（Kämper et al。，2006）。在 ...
|
|
|