| Determination of H+-ATPase Activity in Arabidopsis Guard Cell Protoplasts through H+-pumping Measurement and H+-ATPase Quantification
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] The opening of stomata in plants in response to blue light is driven by the plasma membrane H+-ATPase in guard cells. To evaluate the activation of the H+-ATPase in vivo, we can use H+-pumping by guard cells in response to blue light and fusicoccin. To do this, it is required to prepare a large amount of guard cell protoplasts and measure H+-pumping in the protoplasts. It is also necessary to determine the protein amount of H+-ATPase. In this protocol, we describe the procedures required for these preparations and measurements.
[摘要] 响应蓝光的植物气孔的开放是由保卫细胞中的质膜H + -ATPase驱动的。 为了评价体内H + -ATP酶的激活，我们可以使用H + +保卫细胞对蓝光的响应，fusicoccin。 为此，需要制备大量的保卫细胞原生质体，并测量原生质体中的H + - 抽吸。 还需要确定H + -ATP酶的蛋白质量。 在这个协议中，我们描述了这些准备和测量所需的程序。
【背景】响应于蓝光的气孔的开放是由穿过保卫细胞质膜上的H +介导的膜超极化驱动的（Assmann等，1985; Shimazaki等人，1986），并且是由质膜H + -ATP酶引起的（Kinoshita和Shimazaki，1999）。 H + -ATP酶在膜上产生电化学梯度，并提供植物细胞中许多次级运输所需的能量。然而，测量体内H + -ATP酶活性并不容易。利用保卫细胞的蓝光敏感特性，我们的方法可以将体内H +泵送作为体内测量H + + 使用拟南芥保卫细胞原生质体的ATP酶活性（Ueno等人，2005）。与通过蛋白质印迹（Yamauchi等人，2016）的Hβ+ -ATPase定量一起，该方法允许比较Hβ+ -ATPase活性不同的条件或突变背景。
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| Vacuole Structure Analysis during Cell Death Subsequent to Application of Erwinia carotovora Culture Filtrates to Cell Cultures of Nicotiana tabacum
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Author:
Date:
2015-10-20
[Abstract] We recently established an experimental model system for efficient defense-related cell death using tobacco BY-2 cultured cells treated with culture filtrates of the pathogenic bacterium Erwinia carotovora (E. carotovora) (Hirakawa et al., 2015). Applying this experimental system to transgenic BY-2 cells stably expressing the vacuolar membrane marker GFP-VAM3 (Kutsuna and Hasezawa, 2002) allowed us to monitor changes in vacuolar membrane structures including a decrease of transvacuolar strands during cell death (Hirakawa et al., 2015). Our model system can ...
[摘要] 我们最近建立了使用烟草BY-2培养细胞的有效防御相关细胞死亡的实验模型系统，所述培养细胞用致病性细菌欧文氏菌（Erwinia carotovora）（ E。carotovora （Hirakawa ，，2015）。将该实验系统应用于稳定表达液泡膜标记物GFP-VAM3的转基因BY-2细胞（Kutsuna和Hasezawa，2002），使我们能够监测液泡膜结构的变化，包括细胞死亡期间跨血管链的减少（Hirakawa et al。 al。，2015）。我们的模型系统可以帮助调查细胞器动力学在国防相关的细胞死亡。在这里，我们显示应用 E的协议。 carotovora过滤到BY-2细胞和共聚焦观察液泡膜动力学和随后的细胞死亡。我们使用细胞周期同步的BY-2细胞来有效地监测内陷的液泡膜，例如在我们最近的报告中的跨血管链（Hirakawa等人，2015）;然而，我们不描述本文中的细胞周期同步的协议。对于BY-2细胞同步的逐步方案，请参考先前的方案论文（Nagata和Kumagai，1999; Kumagai-Sano等人，2006）。
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