| Optimized Immunostaining of Embryonic and Early Postnatal Mouse Brain Sections
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] The mammalian neocortex, the outer layer of the cerebrum and most recently evolved brain region, is characterized by its unique areal and laminar organization. Distinct cortical layers and areas can be identified by the protein expression of graded transcription factors and molecular determinants that define the identity of different projection neurons. Thus, specific detection and visualization of protein expression is crucial for assessing the identity of neocortical neurons and, more broadly, for understanding early and late developmental mechanisms and function of this complex system. ...
[摘要] [摘要]哺乳动物的新皮层是大脑的外层，也是最近进化的大脑区域，其特征在于其独特的区域和层状组织。不同的皮质层和区域可以通过分级转录因子的蛋白质表达和定义不同投射神经元身份的分子决定簇来鉴定。因此，蛋白质表达的特异性检测和可视化对于评估新皮层神经元的身份至关重要，更广泛地来说，对于理解这个复杂系统的早期和晚期发育机制和功能至关重要。一些 存在免疫染色/免疫荧光方法来检测蛋白质表达。已发布的方案在细节方面有所不同，可能会影响免疫荧光的最终结果。在这里，我们提供了详细的协议，适用于低温恒温器薄切片和厚振动切片器薄切片，该协议已成功地开发了针对新皮质发育关键分子的抗体。从早期的技术措施测距的大脑采集到的图像分析和统计，我们包括有关样品包容和每一个细节部分ING，幻灯片存储和旨在减少非特异性背景最佳抗体稀释。在实验室中常规使用的，我们的背景优化的免疫染色协议允许区域的有效检测-和层-独特新皮层投射神经元的特定的分子决定因素。
图形摘要：
优化的小鼠脑切片免疫染色方案的工作流程图。一。一个流程图的不同步骤的优化免疫染色协议薄低温恒温器和厚振动切片。乙。例如，用于在薄冠状免疫染色对SATB2和CTIP2部（20 μ ...
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| A Highly Sensitive Anion Exchange Chromatography Method for Measuring cGAS Activity in vitro
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a pattern recognition receptor (PRR) that senses double stranded DNA (dsDNA) in the cytosol and this leads to the activation of stimulator of interferon genes (STING) via the secondary messenger 2’3’-cyclic GMP-AMP (2’3’-cGAMP). STING then recruits TANK binding kinase 1 (TBK-1) and this complex can phosphorylate and activate interferon regulatory factor 3 (IRF3) leading to the induction of type I interferons and other antiviral genes. The cGAS:DNA complex catalyzes the synthesis of 2’3’-cGAMP and the purpose of the protocol presented here is to measure the in ...
[摘要] 环状GMP-AMP合酶（cGAS）是一种模式识别受体（PRR），可以感知胞质溶胶中的双链DNA（dsDNA），并通过第二信使2'3'来激活干扰素基因刺激物（STING）。环GMP-AMP（2'3'-cGAMP）。然后STING募集TANK结合激酶1（TBK-1），该复合物可磷酸化并激活干扰素调节因子3（IRF3），导致I型干扰素和其他抗病毒基因的诱导。 cGAS：DNA复合物催化2'3'-cGAMP的合成，这里提出的方案的目的是测量在dsDNA存在下纯化的cGAS的体外>活性。开发该方案是为了阐明dsDNA长度与cGAS活性水平之间的关系。该方法涉及与低浓度cGAS和dsDNA的体外>反应，然后使用阴离子交换色谱法定量反应产物。当比较不同DNA片段激活cGAS的能力时，低浓度的cGAS和dsDNA以及该测定的高灵敏度是关键优势。
【背景】细胞胞质内存在双链DNA是DNA或逆转录病毒感染的潜在迹象。核苷酸转移酶cGAS作为感知细胞溶质dsDNA的模式识别受体起作用。 cGAS被dsDNA变构激活并催化ATP和GTP转化为环状二核苷酸2'3'-cGAMP（或简称cGAMP）（Ablasser et al。>，2013; Civril et al 。>，2013; Diner et al。>，2013; Gao et al。>，2013; ...
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| Heterologous Expression and Purification of the Magnesium Transporter A (MgtA) in Escherichia coli
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] The magnesium transporter A (MgtA) is a magnesium transporting P-type ATPase present in prokaryotes and plants (Subramani et al., 2016). In Salmonella typhimurium and Escherichia coli (E. coli), MgtA is expressed only in magnesium limiting conditions and plays an important role in Mg2+ homeostasis (Groisman et al., 2013). The transcription of mgtA is regulated by the two-component system PhoP/PhoQ (Soncini et al., 1996; Kato et al., 1999). The membrane bound histidine kinase, PhoQ, senses low Mg2+ ...
[摘要] 镁转运蛋白A（MgtA）是存在于原核生物和植物中的镁转运P型ATP酶（Subramani等，2016）。在鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌（Escherichia coli）（大肠杆菌）中，MgtA仅在镁限制条件下表达，并在Mg2 +稳态中起重要作用（Groisman等，2013）。 mgtA的转录由双组分系统PhoP / PhoQ（Soncini等人，1996; Kato等，1999）调节。膜结合的组氨酸激酶PhoQ感测周质空间中的低Mg2 +浓度，并磷酸化其启动mgtA转录的同源反应调节因子PhoP（Groisman等，2013）。通过将Mg2 +导入细胞质，MgtA靶向质膜并促进低Mg2 +条件下的细菌存活。矮牵牛的MgtA同源物（PH1）在液泡膜中发现，涉及花瓣的着色（Faraco等，2014）。作为理解MgtA Mg2 +转运的分子细节的第一步，我们描述了可用于生物化学和生物物理学研究的大肠杆菌MgtA的纯化的详细方案。在大肠杆菌DH5α中克隆了在N末端具有六氨基组氨酸标签的重组大肠杆菌MgtA，并在大肠杆菌C43（DE3）中通过发酵至OD> 6进行表达。细胞裂解在高压均化器并通过超速离心分离膜。用洗涤剂十二烷基-β-D麦芽糖苷溶解膜蛋白质。通过亲和力和尺寸排阻色谱纯化MgtA。纯化的MgtA的最终产量每3g湿细胞沉淀达到〜1mg MgtA。
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