Preparation, Stimulation and Other Uses of Adult Rat Brain Synaptosomes
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] In this paper, our protocol for preparation of brain synaptosomes is described. Synaptosomes are a valuable model system for analysis of structural components of the synapse as well as for investigation of synaptic function. Synaptosomal preparations are necessary for understanding molecular changes at synapses where critical post-translational modifications of synaptic proteins may occur. Not only are synaptosomes rich in synaptic proteins, but they can be used for analyzing uptake of neurotransmitters into synaptic vesicles and for analysis of the involvement of neurotransmitter synthesis ...
[摘要] 在这篇论文中,我们描述了制备脑突触体的方案。突触体是用于分析突触的结构组分以及用于调查突触功能的有价值的模型系统。突触体制备对于理解可能发生突触蛋白的关键翻译后修饰的突触处的分子变化是必需的。突触小体不仅含有丰富的突触蛋白,还可用于分析神经递质向突触小泡的摄取和神经递质合成和释放的参与分析。可以用增加的钙内流刺激突触体释放神经递质。突触体制剂已被用于表征钙依赖性磷酸化和GABA合成酶GAD65(分子量为65kDa的L-谷氨酸脱羧酶)的活化。通过检查从突触体制剂获得的突触小泡膜上的蛋白质复合物,可以表征GAD65在GABA囊泡释放的偶联合成和囊泡摄取中的作用,这最终导致GABA囊泡释放GABA能神经传递的微调方法。
【背景】突触体制备方法在40多年前在神经科学研究实验室中建立,并且在涉及神经递质释放相关的细胞外钾升高以及对细胞内钙增加的应答方面具有极大的价值。除了阐明神经递质释放的过程之外,突触体制剂已经成为突触囊泡的有价值的来源。关于突触小泡的研究已经被用于表征参与偶联的神经递质合成和囊泡释放的蛋白质组分。突触体制剂作为突触囊泡分离的中间体也是非常有价值的,然后根据位于包含神经递质合成酶的囊泡膜上的蛋白质复合物进行分析。在这方面关键的意义在于包括CSP(胱氨酸 - ...
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Tandem Purification of His6-3x FLAG Tagged Proteins for Mass Spectrometry from Arabidopsis
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Date:
2016-12-05
[Abstract] Tandem affinity purification is a powerful method to identify protein complexes that function in association with a known gene of interest. This protocol describes a methodology to capture proteins tagged with His6-3x FLAG explicitly for the purpose of on-bead digestion and identification by mass spectrometry. The high sensitivity and specificity of our methods allow for purification of proteins expressed at native levels from endogenous promoters to enable uncovering the functional roles of plant protein complexes.
[摘要] 串联亲和纯化是识别与已知感兴趣基因相关联的蛋白质复合物的有力方法。 该方案描述了一种用于捕获用His6-3x FLAG标记的蛋白质的方法,用于通过质谱法进行珠粒消化和鉴定。 我们的方法的高灵敏度和特异性允许从内源启动子纯化以天然水平表达的蛋白质,以揭示植物蛋白复合物的功能作用。 【背景】蛋白质复合物作为信号平台,分子机器和构建细胞生命的支架。鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)或蛋白质复合物的组成对于提供对基因生物化学功能的了解是非常重要的。因此,需要了解发现PPI的简便方法,以了解基因型如何决定植物中的表型。 通常使用的蛋白质纯化方法包括色谱法,例如大小排阻色谱法(也称为凝胶过滤),离子交换层析和亲和层析。通常需要组合几种不同的色谱方法以达到足够的纯度以鉴定相关的复合物。最近,亲和纯化与质谱联用(AP-MS)已经成为系统地鉴定体内蛋白质 - ...
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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay for Detecting Direct and Indirect Protein – DNA Interactions in Magnaporthe oryzae
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Author:
Date:
2015-11-05
[Abstract] Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful technology for analyzing protein-DNA interactions in cells. Robust ChIP procedures have been established for investigating direct interactions between protein and DNA. However, detecting indirect protein-DNA interactions in vivo is challenging. Recently, we used ChIP to analyze an indirect protein-DNA interaction between a putative histone demethylase, MoJmjC, and the promoter of the superoxide dismutase 1-encoding gene MoSOD1 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae (M. oryzae) (Fernandez et al., ...
[摘要] 染色质免疫沉淀(ChIP)是一种强大的技术,用于分析细胞中的蛋白质-DNA相互作用。已建立了稳健的ChIP程序用于研究蛋白质和DNA之间的直接相互作用。然而,在体内检测间接蛋白-DNA相互作用是具有挑战性的。最近,我们使用ChIP来分析推定的组蛋白去甲基化酶MoJmjC和在稻瘟病真菌Magnaporthe oryzae中超氧化物歧化酶1编码基因MoSOD1的启动子之间的间接蛋白质-DNA相互作用( oryzae )(Fernandez ,,2014)。我们用3x FLAG表位标记MoJmjC(Fernandez等人,2014),而不是更大和更常用的GFP表位,以减轻空间位阻。我们还采用了使用DSG和甲醛的两步交联策略,而不是更常用于分析直接蛋白质-DNA相互作用的一步甲醛交联方法,以便更好地捕获间接的MoJm - MoSOD1 DNA相互作用。此外,我们已经表明两步交联适用于GATA转录因子,Asd4及其同源结合位点之间的直接蛋白-DNA相互作用的ChIP分析(Marroquin-Guzman和Wilson,2015)。在这里,我们提供详细的协议的染色质免疫沉淀,与通用的两步交联,在M。 oryzae 。
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