| The RiboPuromycylation Method (RPM): an Immunofluorescence Technique to Map Translation Sites at the Sub-cellular Level
|
|
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] While isotopic labeling of amino acids remains the reference method in the field for quantifying translation rate, it does not provide any information on spatial localization of translation sites. The rationale behind developing the ribopuromycylation method (RPM) was primarily to map translation sites at the sub-cellular level while avoiding detection of newly synthesized proteins released from ribosomes. RPM visualizes actively translating ribosomes in cells via standard immunofluorescence microscopy in fixed and permeabilized cells using a puromycin-specific monoclonal antibody to detect ...
[摘要] 尽管氨基酸的同位素标记仍然是用于定量翻译速率的领域中的参考方法，但是其不提供关于翻译位点的空间定位的任何信息。 开发ribopuromycylation方法（RPM）的基本原理主要是在亚细胞水平上绘制翻译位点，同时避免检测从核糖体释放的新合成的蛋白质。 RPM通过使用嘌呤霉素特异性单克隆抗体的固定的和透化的细胞中的标准免疫荧光显微镜可视化主动翻译细胞中的核糖体以检测捕获在用链延长抑制剂处理的核糖体上的嘌呤化新生链。
【背景】几十年来，氨基酸的同位素标记被认为是研究蛋白质翻译的金标准。虽然这种方法已被证明是非常准确的评估翻译率，它没有提供翻译核糖体的位置信息。最近，氨基酸类似物使荧光检测新生链（Dieterich等人，2007）。然而，几乎所有检测到的信号都来自核糖体释放的多肽。我们最初的想法是开发一种方法来标记新生链，同时还束缚于翻译核糖体。
嘌呤霉素（PMY）是一种氨基糖苷类抗生素，模拟带电荷的tRNA Tyr并掺入核糖体A位点。因此，PMY通过核糖体催化 - ...
|
|
|
| Heavy Metal Stress Assay of Caenorhabditis elegans
|
|
Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Organisms have developed many protective systems to reduce the toxicity from heavy metals. The nematode Caenorhabditis elegans has been widely used to determine the protective mechanisms against heavy metals. Responses against heavy metals can be monitored by expression of reporter genes, while sensitivity can be determined by quantifying growth or survival rate following exposure to heavy metals.
[摘要] 生物开发了许多保护系统，以减少重金属的毒性。线虫秀丽隐杆线虫已广泛用于确定重金属的保护机制。可以通过报告基因的表达来监测对重金属的反应，而敏感性可以通过量化暴露于重金属后的生长或存活率来确定。
背景 一些重金属如砷，镉和汞已知对包括人类在内的大多数生物有害（Valko et al。，2005）。为了降低这些金属的毒性，生物开发出各种保护系统。线虫秀丽隐杆线虫已被用于了解重金属的保护机制。以前的研究表明，许多基因，如解毒酶，转录因子和信号传导因子都参与了该生物体中重金属的保护（Broeks et al。，1996; Mizuno et al。 ，2004; Inoue等人，2005; Schwartz等人，2010）。除了测量报告基因表达外，生存力和生长的测定通常用于监测重金属在C中的影响。线虫。在本协议中，我们描述了使用C测定砷，铜和镉的方法。线虫。
|
|
|
| Determination of Keto-deoxy-d-manno-8-octanoic acid (KDO) from Lipopolysaccharide of Escherichia coli
|
|
Author:
Date:
2015-12-20
[Abstract] 2-Keto-3-deoxy-octonate (KDO) is an essential constituent of lipopolysaccharide (LPS) that forms the outermost leaflet of Gram-negative bacterial outer membrane. LPS is mainly composed of lipid A, O-antigen and a core oligosaccharide. Two molecules of KDO are present per one molecule of LPS. A proper level of LPS is required to maintain the outer membrane integrity and either high or low levels of LPS are toxic to the cell. Various methods are available for quantification of LPS; of these, determination of KDO is a simple and accurate method and it can be estimated either directly from crude ...
[摘要] 2-酮-3-脱氧 - 辛酸（KDO）是形成革兰氏阴性细菌外膜的最外侧叶的脂多糖（LPS）的必需成分。 LPS主要由脂质A，O-抗原和核心寡糖组成。每一分子LPS存在两个KDO分子。需要适当水平的LPS以维持外膜完整性，并且高或低水平的LPS对细胞有毒性。各种方法可用于定量LPS;其中，KDO的测定是简单和准确的方法，并且可以通过简单的比色测定直接从粗制细菌细胞裂解物或从纯化的LPS估计。尽管该方法可以理论上用于任何革兰氏阴性菌，我们常规地使用它来测量来自大肠杆菌（大肠杆菌）K12菌株的细胞裂解物的KDO。 br /> 方法：协议取自Karkhanis等人（1978）。它是一种测量KDO的简单，灵敏和可靠的方法。该测定在细胞裂解物或LPS完全酸水解后释放LPS的各种组分进行。此外，与高碘酸盐，亚砷酸盐和硫代巴比妥酸的反应产生粉红色至红色的发色团，其在用DMSO稳定后在548nm测量。
|
|
|