| Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo ...
[摘要] [摘要] 反式高尔基体网络（TGN）上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质，半完整的哺乳动物细胞和核苷酸，在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定，如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。
[背景] 的反式高尔基体网络（TGN）是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度，真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中，然后运至特定的目的地（Guo 等人，2014）。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解，重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网（ER）将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立（Kim 等，2005; Kim 等，2007; Merte 等，2010; Yuan 等。，2018；Niu 等，2019；）。已经开发出一种体外测定法，其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放（Ponnambalam 等，1996；Wakana ...
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| GC-MS-Based Analysis of Methanol: Chloroform-extracted Fatty Acids from Plant Tissues
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Fatty acids (FAs) are carboxylic acids with long aliphatic chains that may be straight, branched and saturated or unsaturated. Most of the naturally occurring plant FAs contains an even number of carbon (C4-C24). FAs are used in food and pharmacological industries due to their nutritional importance. In addition, FAs are considered as a promising alternative for the production of biodiesel from terrestrial plant biomass. To establish commercial applications, more reliable analytical methods are needed for the identification, quantification, and composition determination of FAs. Here, we ...
[摘要] 脂肪酸（FAs）是具有长脂肪链的羧酸，其可以是直链，支链和饱和或不饱和的。大多数天然存在的植物FA含有偶数碳（C4-C24）。由于其营养重要性，FA用于食品和药理学工业。此外，FAs被认为是从陆地植物生物质生产生物柴油的有前途的替代品。为了建立商业应用，需要更可靠的分析方法来确定FA的鉴定，定量和组成。在这里，我们描述了一种相对快速和灵敏的方法，用于从少量植物组织中提取，鉴定和量化FA。该方法包括脂质提取，通过转甲基化将脂质转化为脂肪酸甲酯（FAME），使用气相色谱 - 质谱（GC-MS）鉴定和定量FAME的步骤。在该方案中，在GC-MS分析之前添加内标。每个FA的量由其相对于内标峰面积的峰面积计算。
【背景】脂肪酸的合成对于代谢能的储存是重要的。不断增长的人口和能源成本强调了生产可持续可再生燃料的必要性。第二代生物燃料的来源是非食用油籽作物或木质纤维素生物质，主要包括作物植物的废弃物，如多年生草，包括柳枝稷，果壳，稻草和森林残留物（Hadar，2013）。在这种情况下，植物可以作为研究脂肪酸用于营养保健品和生物柴油方面的优秀系统。此外，在生物柴油生产中，燃料的清洁燃烧性质受到FA的结构特征的影响，包括链长和不饱和度（Knothe，2005）。木质纤维素生物质是直接从经济有效的资源生产这些产品的更环保的替代品。使用GC-MS进行FA分析可以对单一植物提取物中相对多种脂肪酸进行标准化，注释和定量。脂质提取的效率取决于溶剂的极性。极性脂质（如糖脂或磷脂）更易溶于极性溶剂（如醇类），非极性脂质（如三酰基甘油）更易溶于非极性溶剂（如氯仿）。因此，总脂质提取取决于有机溶剂的性质。 ...
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| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
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