| Measurement of RNA-induced PKR Activation in vitro
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Protein kinase R (PKR) is one of the key RNA-activated sensors for innate immunity. PKR is activated by pathogenic or aberrant RNAs such as short double-stranded RNAs or those with imperfect secondary structures, as well as a reduction in the amount and number of RNA modifications. Activation of PKR may be an underlying mechanism for the pathogenesis of human diseases. In this protocol, I describe a method for studying levels of RNA-induced PKR activation in vitro.
[摘要] 蛋白激酶R（PKR）是先天免疫的核心RNA激活传感器之一。 PKR由致病性或异常RNA如短双链RNA或具有不完全二级结构的RNA激活，以及RNA修饰的量和数量的减少。 PKR的激活可能是人类疾病发病机制的潜在机制。在本协议中，我描述了一种在体外研究RNA诱导的PKR激活水平的方法。
背景 PKR是四种哺乳动物激酶之一，其响应于应激信号磷酸化真核起始因子2-α亚基（eIF2α）。 PKR主要是响应于病毒感染而激活（Holcik和Sonenberg，2005）。 PKR是识别和结合病原RNA的先天免疫的关键组成部分。 RNA与PKR的相互作用促进并稳定其二聚化。然后PKR经历自身磷酸化，随后磷酸化eIF2α以切断一般翻译，同时激活下游信号级联，包括增加的ATF4应激反应转录因子的翻译（Hinnebusch，2005）。
＆nbsp;已知PKR被短双链RNA激活（Manche等人，1992; Zheng和Bevilacqua，2004）以及具有一些不完全二级结构的RNA，例如发夹环（Bevilacqua 等人，1998）。此外，RNA生物发生缺陷，包括较低水平的m ...
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| Displacement-based ELISA: Quantifying Competition between Two Binding Partners for Interaction with a His-tagged Ligand Immobilized on a Ni2+-NTA Plate
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Author:
Date:
2016-03-05
[Abstract] The displacement assay was designed to quantify the direct competition between two homologous ribosomal proteins from Mycobacterium tuberculosis, S18-1 and S18-2, for interaction with their cognate binding partner, ribosomal protein S6 (Prisic et al., 2015). The S18 proteins were dialyzed in two physiologically relevant conditions (i.e. in the presence of Zn2+ or with EDTA to chelate Zn2+) and then allowed to compete for binding to S6 which was maintained in limiting concentration. The result was obtained through an ELISA, where S6-His is first ...
[摘要] 设计置换测定以定量来自结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）S18-1和S18-2的两个同源核糖体蛋白质之间的直接竞争，用于与它们的同源结合伴侣，核糖体蛋白S6（Prisic et al。，2015）。 S18蛋白质在两种生理相关条件下（即在Zn 2+ 2+存在下或用EDTA螯合Zn 2+ 2+）进行透析，并且然后允许竞争结合S6，其维持在有限浓度。通过ELISA获得结果，其中S6-His首先结合Ni 2+ 2+ -NTA板，然后加入超过S6的S18-2，然后加入递增浓度的S18-1。在化学发光ELISA中用S18-2蛋白和第二抗体特异性的抗体定量保留结合S6的S18-2的百分比。以这种方式，S18-1蛋白质被S18-1蛋白质的置换报告为通过用S18-2饱和S6实现的全强度信号的百分比。在其基础上，该方法利用天然蛋白质 - 蛋白质相互作用，并且可以应用于其中两种或更多种蛋白质竞争结合上述靶配体的其他系统。
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| Hepatitis C virus Cell-to-cell Spread Assay
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Author:
Date:
2014-12-20
[Abstract] Hepatitis C virus (HCV) can infect naïve cells via entry of “cell-free” extracellular virus or direct “cell-to-cell” transmission. Here, we describe an assay for detecting HCV cell-to-cell transmission, using a non-growing cell culture system that avoids confounding effects of cell growth. The assay consists of infecting a small number of cells in a confluent monolayer and then blocking subsequent cell-free extracellular virions with a neutralizing antibody such that only cell-to-cell transmission may occur. Under these conditions, incubation at 37 °C results in the formation of infected cell ...
[摘要] 丙型肝炎病毒（HCV）可通过"无细胞"细胞外病毒的进入或直接的"细胞到细胞"传递而感染初始细胞。 在这里，我们描述检测HCV细胞到细胞传播，使用一个非增长的细胞培养系统，避免细胞生长的混杂效应的测定。 该测定法包括感染汇合单层中的少量细胞，然后用中和抗体阻断随后的无细胞的细胞外病毒粒子，使得仅可发生细胞与细胞的传递。 在这些条件下，在37℃下孵育导致感染的细胞病灶的形成。 然后可以通过计数每个焦点中的细胞数量来确定细胞与细胞扩散的程度。 可以修改测定以评估抑制剂和/或特异性细胞基因对HCV的细胞与细胞扩散的影响。
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