| Snapshots of the Signaling Complex DesK:DesR in Different Functional States Using Rational Mutagenesis and X-ray Crystallography
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] We have developed protocols to generate site-specific variants of the histidine-kinase DesK and its cognate response regulator DesR, conducive to trapping different signaling states of the proteins. Co-expression of both partners in E. coli, ensuring an excess of the regulator, was essential for soluble production of the DesK:DesR complexes and further purification. The 3D structures of the complex trapped in the phosphotransferase and in the phosphatase reaction steps, were solved by X-ray crystallography using molecular replacement. The solution was not trivial, and we found that in ...
[摘要] 我们已经开发了产生组氨酸激酶DesK及其同源反应调节物DesR的位点特异性变体的方案，有助于捕获蛋白质的不同信号状态。两个合作伙伴在大肠杆菌中的共表达，确保调节剂过量，对于DesK：DesR复合物的可溶性生产和进一步纯化是至关重要的。通过使用分子置换的X射线晶体学解决了捕获在磷酸转移酶和磷酸酶反应步骤中的复合物的3D结构。该解决方案不是微不足道的，我们发现在用作搜索探针的硅片生成的模型中，有助于将大部分复合物放置在不对称单元中。电子密度图就足够清楚了，可以进行人工建模，获得完整的原子模型。这些方法有助于解决细菌信号领域的主要挑战，即获得稳定的激酶：调节复合物，具有不同的构象状态，适用于高分辨率晶体学研究。
【背景】关于细菌信号复合物，特别是双组分系统（TCS）的结构信息仍然很少（Casino et al。，2009; Gao and Stock，2009）。 TCS包含几乎所有细菌中的感觉组氨酸激酶（HK）和响应调节剂（RR）配偶体，它们允许细胞感知环境并通过适应性反应相应地反应。尽管在信号传输中这种切换机制的重要性（Trajtenberg等，2016），结构信息对于采用不同功能状态的TCS复合体甚至更为有限。我们研究了DesK-DesR途径（de Mendoza，2014），一种来自枯草芽孢杆菌的TCS，其参与调节细胞膜组成以适应降低双层流动性的线索，如冷休克。 ...
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| Quantification of Chlorophyll as a Proxy for Biofilm Formation in the Cyanobacterium Synechococcus elongatus
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] A self-suppression mechanism of biofilm development in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 was recently reported. These studies required quantification of biofilms formed by mutants impaired in the biofilm-inhibitory process. Here we describe in detail the use of chlorophyll measurements as a proxy for biomass accumulation in sessile and planktonic cells of biofilm-forming strains. These measurements allow quantification of the total biomass as estimated by chlorophyll level and representation of the extent of biofilm formation by depicting the relative fraction of ...
[摘要] 最近报道了蓝细菌聚球蓝细菌PCC 7942中生物膜发育的自我抑制机制。 这些研究需要定量由生物膜抑制过程中受损的突变体形成的生物膜。 在这里，我们详细描述了叶绿素测量作为生物膜形成菌株无菌和浮游细胞中生物量积累的代用途。 这些测量可以通过叶绿素水平估计的总生物量进行定量，并通过描绘浮游细胞中叶绿素的相对分数来表示生物膜形成的程度。
【背景】几个最近发表的研究表明，蓝藻中细胞聚集和生物膜发育的基础的机制的新兴兴趣（Fisher等人，2013; Jittawuttipoka等人，2013; 2014; Enomoto等人，2014; Schwarzkopf等人，2014; Enomoto等人，，2015; Oliveira等人，2015; Agostoni等人，2016; Parnasa等人，2016）。我们最近报道了一种自生物膜抑制机制，其决定了单细胞蓝细菌聚球蓝细菌PCC 7942（Schatz等人，2013; Nagar和Schwarz，2015）的浮游生长）。通过灭活特定基因来消除生物膜抑制过程导致在这种其他浮游菌株（Schatz等人，2013; ...
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| Microvesicle Isolation from Rat Brain Extract Treated Human Mesenchymal Stem Cells
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Microvesicle (MVs) are submicron-sized membranous vesicles that are either actively released from cells via secretory compartments or shed from cell surface membranes. MVs are generated by many cell types and serve as vehicles that transfer biological information (e.g., protein, mRNA, and miRNA) to distant cells, thereby affecting their gene expression, proliferation, differentiation, and function. Although their physiological functions are not clearly defined, recent studies have shown their therapeutic potential for tissue repair and regeneration. While MVs can be isolated readily ...
[摘要] 微囊泡（MV）是亚微米尺寸的膜泡囊，其通过分泌室从细胞中积极释放或从细胞表面膜脱落。 MV由许多细胞类型产生并且用作将生物信息（例如，蛋白质，mRNA和miRNA）转移到远端细胞的载体，从而影响其基因表达，增殖，分化和功能。 虽然他们的生理功能没有明确定义，但最近的研究已经显示出其组织修复和再生的治疗潜力。 虽然MV可以从间充质干细胞（MSC）和来自各种来源的其他细胞类型容易地分离，但在体外常规培养条件下MV的产量是限制因素之一， 功能研究以及体外分析分析。 在这里，我们提供了一个通过大鼠脑提取物预处理MSC增加微泡产量的方案。
【背景】通过直接重编程或利用间充质干细胞进行细胞替代治疗来产生神经干细胞或神经细胞是神经变性疾病的潜在选择（Adib等人，2015）。最近的研究已经证明，来自MSC的微泡代表了增强组织再生，例如神经元再生，免疫调节，脑损伤中的血管发生的其他细胞替代方法的新颖且安全的替代方案（Kim等人，2013） ; Porro等，，2015; Lee等人，2016）。对受损组织外源信号如何影响微泡数量和组成的了解甚少。 MSCs的功能分泌物的含量和数量可以根据微环境的显着变化（Qu等人，2007）。例如，已知缺血性脑提取物或缺氧诱导合成有益于组织再生过程的许多细胞因子和生长因子（Chen等，2007; Shin et ...
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