| Generation of Gene Knockout and Gene Replacement with Complete Removal of Full-length Endogenous Transcript Using CRISPR-Trap
|
|
Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] This protocol describes the application of the CRISPR-Trap from designing of the gene targeting strategy to validation of successfully edited clones that was validated on various human cell lines, among them human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). The advantage of CRISPR-Trap over conventional approaches is the complete removal of any endogenous full-length transcript from the target gene. CRISPR-Trap is applicable for any target gene with no or little coding sequence in its first exon. Several human cell lines and different genes have so far been edited successfully with CRISPR-Trap.
[摘要] 该协议描述了CRISPR-Trap从设计基因靶向策略到验证成功编辑的克隆的应用，所述克隆在各种人细胞系上得到验证，其中人类诱导的多能干细胞（hiPSC）。 CRISPR-Trap优于常规方法的优点是从靶基因完全去除任何内源全长转录物。 CRISPR-Trap适用于在其第一个外显子中没有编码序列或编码序列很少的任何靶基因。 到目前为止，已经使用CRISPR-Trap成功编辑了几种人细胞系和不同基因。
【背景】CRISPR / Cas9技术的出现促进了基因敲除和基因编辑的基因组靶向。执行敲除的常规方法依赖于引入移码导致过早终止密码子（PTC），截短开放阅读框（ORF）以及随后通过无义介导的mRNA衰变（NMD）降解靶基因的转录物。 。这种方法的一个可能的缺陷是全长转录物，其可以逃避NMD并产生具有残余或甚至显性负功能的C末端截短蛋白。该协议提出了CRISPR-Trap，这是我们最近建立的一种方法（Reber et al。>，2018），成功编辑后将阻止从靶基因位点表达任何全长转录本（图1）。简而言之，这种方法针对CRISPR / ...
|
|
|
| Phagocytosis Assay of Necroptotic Cells by Cardiac Myofibroblasts
|
|
Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] In myocardial infarction (MI), a plenty of cardiomyocytes undergo necrosis and necroptosis due to the lack of oxygen and nutrients. The dead cardiomyocytes are promptly engulfed by phagocytes. When the dead cells are not engulfed, the noxious contents of the cells are released outside, and thus, induce inflammation, and obstruct the function of organs. Therefore, phagocytosis is crucial for maintaining homeostasis of organs. Herein, we describe a protocol of an in vitro phagocytosis assay of necroptotic cells.
[摘要] 在心肌梗死（MI）中，由于缺氧和营养，大量心肌细胞发生坏死和坏死。 死亡心肌细胞迅速吞噬吞噬细胞。 当死细胞不被吞没时，细胞的有害物质被释放到外部，从而引起炎症，并阻碍器官的功能。 因此，吞噬对维持器官的体内平衡至关重要。 在这里，我们描述了一种神经细胞的体外吞噬作用测定方案。
【背景】以前，认为坏死性坏死细胞和坏死核细胞只能通过心脏巨噬细胞在失败的心脏中消除。 然而，我们发现负责组织纤维化的心脏肌成纤维细胞在MI后吞噬死细胞（Nakaya等，2017）。 本文中，我们提供了一种细胞凋亡细胞的体外吞噬作用的详细方案，采用在caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK中通过TNF-α刺激进行人脑坏死的L929细胞。
|
|
|
| An Assay to Determine Phagocytosis of Apoptotic Cells by Cardiac Macrophages and Cardiac Myofibroblasts
|
|
Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] In myocardial infarction (MI), a number of cardiomyocytes undergo apoptosis. These apoptotic cardiomyocytes are promptly engulfed by phagocytes. If the dead cells are not engulfed, their noxious contents are released outside, resulting in induction of inflammation. Therefore, the removal of these dead cells is necessary. However, the contribution of each phagocyte type to the removal of apoptotic cells in infarcted hearts remains unresolved. Here, we describe an in vitro protocol for a phagocytosis assay to compare the engulfment ability of cardiac macrophages and cardiac ...
[摘要] 在心肌梗死（MI）中，许多心肌细胞凋亡。 这些凋亡心肌细胞被吞噬细胞迅速吞噬。 如果死细胞没有被吞没，其有害物质被释放到外面，导致炎症的诱导。 因此，需要去除这些死细胞。 然而，每个吞噬细胞类型对梗塞心脏中凋亡细胞的去除的贡献仍未解决。 在这里，我们描述了吞噬作用测定的体外方案来比较心脏巨噬细胞和心脏肌成纤维细胞的吞噬能力。
【背景】长期以来一直认为，心脏巨噬细胞消除了失败的心脏中产生的凋亡细胞。 然而，我们发现负责组织纤维化的心脏肌成纤维细胞也具有在MI后吞噬凋亡细胞的能力（Nakaya等，2017）。 这一发现促使我们比较心脏巨噬细胞和心脏肌成纤维细胞的吞噬能力。 在这里，我们提供了一个详细的体外吞噬试验方案来评估吞噬吞噬的程度。
|
|
|