| Molecular Size Analysis of Recombinant Importin-histone Complexes Using Analytical Ultracentrifugation
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Author:
Date:
2020-05-20
[Abstract] Histones constitute the protein components of nucleosomes. Despite their small sizes, histones do not diffuse through the nuclear pore complex. Instead, they are transported to the nucleus by importins, either alone or in complex with histone chaperones. Determining the molecular size of the importin-histone complexes is key to understanding the mechanism of histone transport and also the potential roles of importins as histone chaperones and in the assembly of nucleosomes. Here we report a simple and reproducible sedimentation-velocity based method to determine the molecular sizes of ...
[摘要] [摘要] 组蛋白构成核小体的蛋白质成分。尽管其尺寸很小，但组蛋白不会通过核孔复合物扩散。取而代之的是，它们单独或与组蛋白分子伴侣复合地被重要蛋白转运至细胞核。确定importin-histone复合物的分子大小是理解组蛋白转运机制的关键，也是importins作为组蛋白伴侣和在核小体组装中的潜在作用的关键。在这里，我们报告了一种简单且可重现的沉降速度为基础的方法，该方法使用分析超速离心法来确定importin-histone配合物的分子大小。该方法不使用任何报告子标签或与色谱柱树脂的相互作用，从而分析了天然蛋白质的相互作用。
[背景] 核小体是真核染色质的最基本的结构和功能单元。组蛋白H2A，H2B，H3和H 4是核小体的蛋白质成分。每个核包括147个碱基的DNA wrapp的对编绕Ñ H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体的两个拷贝（Luger的等人，1997年一）。像细胞中的其他蛋白质一样，组蛋白在细胞质中合成。然而，核小体组装在核中。尽管它们的小尺寸（单体是10-15 kDa）的，组蛋白不通过核孔复合物扩散，而是可以单独使用或在复合物与由组蛋白importins伴侣输送要么（约翰逊-SAL IBA 等人，2000 ; Baake 等等人，2001；Mosammaparast 等人，2001，2002a和2002b；Muhlhausser ...
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| Purification of Soluble Recombinant Human Tau Protein from Bacteria Using Double-tag Affinity Purification
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Author:
Date:
2018-11-20
[Abstract] Dysfunction of the microtubule-associated protein Tau (encoded by the MAPT gene) has been implicated in more than twenty neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s. As such, the physiological and disease-relevant functions of Tau have garnered great interest in the research community. One barrier hampering investigations into the functions of Tau and the generation of pharmacological agents targeting Tau has been the difficulty of obtaining soluble Tau protein in purified form. Here, we describe a protocol that uses dual affinity tag purification to selectively purify soluble ...
[摘要] 微管相关蛋白Tau（由 MAPT 基因编码）的功能障碍已经涉及20多种神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病。 因此，Tau的生理和疾病相关功能引起了研究界的极大兴趣。 妨碍对Tau功能的研究和产生靶向Tau的药理学试剂的一个障碍是难以获得纯化形式的可溶性Tau蛋白。 在这里，我们描述了一种方案，该方案使用双亲和标签纯化从细菌中选择性纯化可溶性重组Tau蛋白，所述细菌对于下游应用具有功能活性，包括免疫，微管结合测定和蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。
【背景】Tau传统上被定义为微管结合蛋白;然而，在人类疾病中，Tau可以与轴突微管分离并错误定位到其他神经元区室，包括体细胞，树突和突触，其中与非微管蛋白和结构的相互作用驱动神经元功能障碍（Iqbal et al。 ，2016; Wang和Mandelkow，2016; Zhou et al。，2017; McInnes et al。，2018）。尽管神经原纤维缠结形式的Tau聚集体通常存在于死后患病的脑组织中，但研究表明，可溶性Tau，而不是聚集的Tau，是神经元功能障碍的主要原因（Crimins et al。，2012 ; Polydoro et al。，2014; Koss et al。，2016）。因此，研究Tau在疾病中的可溶性功能，例如鉴定蛋白质 - ...
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| Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay: a Simple and Versatile Method for Visual Detection of Protein-protein Interactions
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] The visible immunoprecipitation (VIP) assay is a convenient alternative to conventional co-immunoprecipitation (Katoh et al., 2015). By processing lysates from cells co-expressing GFP-fusion and RFP-fusion proteins for immunoprecipitation with GST-tagged anti-GFP Nanobody and glutathione-Sepharose beads, protein-protein interactions can be visualized by directly observing the beads bearing immunoprecipitates under a fluorescence microscope. This assay can examine a large number of protein combinations at one time, without requiring time-consuming procedures, including SDS-PAGE and ...
[摘要] 可见的免疫沉淀（VIP）测定是常规免疫共沉淀的方便的替代方法（Katoh等人，2015）。通过处理来自共表达GFP融合蛋白和RFP融合蛋白的细胞的裂解物以用GST标记的抗GFP纳米抗体和谷胱甘肽琼脂糖珠粒进行免疫沉淀，可以通过在荧光显微镜下直接观察带有免疫沉淀物的珠来显现蛋白质 - 蛋白质相互作用。该检测方法可以一次检测大量的蛋白质组合，无需耗时的操作，包括SDS-PAGE和免疫印迹。此外，VIP测定可以检查复杂的一对多和多对多的蛋白质相互作用。 VIP测定的另一个重要的点是使用纳米抗体进行免疫沉淀。纳米抗体是来自骆驼科（骆驼和亲戚）的单域抗体。由于其体积小，高亲和力，高特异性和稳定性，因此在E中表达的抗GFP纳米抗体。大肠杆菌可以大规模纯化，并且实际上用于免疫沉淀实验。在这里，我们描述了制备GST标记的抗GFP纳米抗体和VIP测定的方案。
【背景】细胞中的几乎所有蛋白质都通过与其他蛋白质相互作用起作用。揭示蛋白质 - 蛋白质相互作用网络是了解蛋白质功能的关键。已经开发了多种方法，例如酵母双杂交系统，GST pull-down和免疫共沉淀来分析蛋白质 - 蛋白质相互作用。最近，我们开发了一种称为可见免疫沉淀（VIP）测定的蛋白质 - 蛋白质相互作用分析的新方法（Katoh等人，2015）。 ...
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