| Method for Multiplexing CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae Using Artificial Target DNA Sequences
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Genome manipulation has become more accessible given the advent of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) editing technology. The Cas9 endonuclease binds a single stranded (single guide) RNA (sgRNA) fragment that recruits the complex to a corresponding genomic target sequence where it induces a double stranded break. Eukaryotic repair systems allow for the introduction of exogenous DNA, repair of existing mutations, or deletion of endogenous gene products. Targeting of Cas9 to multiple genomic positions (termed ‘multiplexing’) is achieved by the expression of ...
[摘要] 鉴于CRISPR（集群定期间隔短回归重复）编辑技术的出现，基因组操纵变得更加易于使用。 Cas9核酸内切酶将募集复合物的单链（单向导）RNA（sgRNA）片段结合到相应的基因组靶序列，引发双链断裂。真核修复系统允许引入外源DNA，修复现有突变或内源基因产物的缺失。通过在同一核内表达多个sgRNA来实现Cas9对多个基因组位置的定位（称为“多重”）。然而，CRISPR领域的持续关注是将Cas9意外地定位到基因组内的替代（“脱靶”）DNA位置。我们将安装的人造Cas9靶序列的使用（称为人造基因座上的Cas9复制）描述为允许（i）与单个sgRNA复用的酵母基因组中的用途; （ii）减少/消除可能的脱靶效应，以及（iii）精确控制预定目标序列的放置。
【背景】CRISPR（集群定期间隔回归重复）机制已经在原核生物中演变为具有很高精度编辑任何基因组的能力的原始适应性免疫系统（Jinek等，2012; Sorek等，2013）。这种生物技术需要使用来自化脓性链球菌（或othologous物种）的内切核酸酶（Cas9），单个RNA'引导'序列和外源供体DNA（如果需要）。仅在短短几年内，CRISPR / ...
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| Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Assay to Measure the Dynamics of Fluorescence Tagged Proteins in Endoplasmic Reticulum Membranes of Plant Cells
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Author:
Date:
2014-10-20
[Abstract] In this protocol, we used fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) to measure the influence that some mutations and drug treatment have on mobility of a green fluorescent protein (GFP)-fused viral transmembrane protein into endoplasmic reticulum membranes (Serra-Soriano et al., 2014). The proteins of interest were transiently expressed in Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) epidermic cells by agro-infiltration. To minimize transient overexpression artifacts, fluorescence intensity values were gathered at 36 hpi using an inverted Zeiss LSM 780 confocal ...
[摘要] 在该协议中，我们使用光漂白（FRAP）后的荧光恢复来测量一些突变和药物治疗对于将绿色荧光蛋白（GFP） - 融合的病毒跨膜蛋白移动到内质网膜中的影响（Serra-Soriano， et al。，2014）。感兴趣的蛋白质通过农杆菌浸润在烟草（Nicotiana benthamiana）（本塞姆氏烟草）表皮细胞中瞬时表达。为了使瞬时过表达伪像最小化，使用倒置Zeiss LSM 780共聚焦显微镜在36hpi收集荧光强度值。只有表现出中等表达水平和通过GFP标记的蛋白的ER的均匀分布的表皮细胞用于进一步的实验。为了检查肌动蛋白聚合在GFP标记的蛋白质的动员中的作用，我们用拉特管素B，肌动蛋白聚合的抑制剂或用DMSO作为对照预处理组织样品。使用所产生的荧光恢复曲线来获得对应于流动级分的最大荧光回收率（MFR）的百分比和最大回收的半衰期（t 1/2）/sub>）值。
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| Agrobacterium-mediated Transformation of Strawberry
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Author:
Date:
2014-01-05
[Abstract] Traditional breeding for improvement of strawberry (Fragaria x ananassa) is difficult because strawberry is an octoploid, hybrid species. Genetic modification of strawberry would though be a promising alternative for obtaining the desired improvements in existing elite strawberry cultivars (Schaart et al., 2011). The availability of suitable genes for trait improvements in strawberry has however been a rate-limiting step until recently, but with the completion of the sequencing of the genome of woodland strawberry (F. vesca) (Shualev et al., 2011), we now ...
[摘要] 由于草莓是八倍体，杂种物种，用于改善草莓（ Fragaria x ananassa ）的传统育种是困难的。草莓的遗传修饰虽然是获得现有的优良草莓栽培品种所期望的改进的有希望的替代方法（Schaart等人，2011）。然而，随着草地草莓基因组测序的完成（Shualev ），用于草莓中性状改善的合适基因的可用性是速率限制步骤 et al。，2011），我们现在可以获得宝贵的候选基因宝库。对于草莓，遗传转化的方法最初由Nehra等人（1990）和James等人（1990）描述，并且转化的成功被证明是高度的品种依赖。草莓转化的最新进展由Husaini等人审查（2011）。在我们的实验室中，草莓的转化是基于由Passey等人（2003）描述的苗再生方法和使用超强毒力土壤杆菌菌株AGL0（Lazo et al。，1991）。我们主要利用草莓转化作为候选基因功能分析的工具。为此，栽培品种Calypso是非常合适的基因型，因为其高转化效率（高达100％）和永不结实的特性，一旦植物开始开花，其提供草莓果实的连续供应。
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