| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Production of Labeled Probes for Single-molecule FISH or RNA Capture
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Arrays of short, singly-labeled ssDNA oligonucleotides enable in situ hybridization with single molecule sensitivity and efficient transcript specific RNA capture. Here, we describe a simple, enzymatic protocol that can be carried out using basic laboratory equipment to convert arrays of PCR oligos into smFISH and RAP probesets in a quantitative, cost-efficient and flexible way.
[摘要] 短的，单标记的ssDNA寡核苷酸阵列使得能够与单分子灵敏度和有效的转录物特异性RNA捕获进行原位杂交。 在这里，我们描述了一个简单的酶促协议，可以使用基本的实验室设备将PCR寡核苷酸阵列以定量，成本高效和灵活的方式转换为smFISH和RAP探针组。
【背景】合成来源的多个单标记的短寡核苷酸的使用极大地改进了对特异性转录物的高特异性和单分子灵敏度的检测（Femino等人，1998; Raj等人。，2008）。这种探针分子与经典使用的长核酸探针相比具有改进的穿透性并且需要更温和的杂交条件，从而更好地保存标本的结构（例如，Little等人 >，2015，Gaspar 等，2017a）。由于在该设计中多个寡核苷酸 - 通常24-96-靶向相同转录物的不同部分，因此在非特异性背景上在特异性靶分子上发生信号累积，这与由长的多标记探针产生的相等信号相反（Raj ，2008）。此外，由于单个短探针的标记是定量的 - 与长探针的随机标记相反 - ...
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| Optical Clearing Using SeeDB
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Author:
Date:
2014-02-05
[Abstract] We describe a water-based optical clearing agent, SeeDB (See Deep Brain), which clears fixed brain samples in a few days without quenching many types of fluorescent dyes, including fluorescent proteins and lipophilic neuronal tracers. SeeDB is a saturated solution of fructose (80.2% w/w) in water with 0.5% α-thioglycerol. In standard SeeDB optical clearing procedure, we treat paraformaldehyde-fixed embryo and brain samples with increasing concentrations of aqueous fructose solutions, and finally equilibrate them in SeeDB. The entire procedure takes approximately three days. Unlike previous ...
[摘要] 我们描述了一种水基光学清除剂，SeeDB（参见深脑），其在几天内清除固定的脑样品，而不淬灭许多类型的荧光染料，包括荧光蛋白和亲脂性神经元示踪剂。 SeeDB是果糖（80.2％w/w）在含有0.5％α-硫代甘油的水中的饱和溶液。在标准的SeeDB光学清除程序中，我们用增加浓度的果糖水溶液处理多聚甲醛固定的胚胎和脑样品，并且最后在SeeDB中平衡它们。整个过程大约需要三天。与以前的方法不同，该方法在清除过程中保持恒定的样品体积，这是保持细胞形态完整的重要因素。光学清除后，我们可以达到>在共聚焦显微镜下为1,000μm。当与双光子显微镜结合时，SeeDB允许我们以毫米级别水平成像固定的小鼠大脑。这种方法有助于全面和定量分析理解神经元电路，在成人和发展中国家的小鼠大脑。还提供了SeeDB变体（参见DB37）和优化的程序（见DBp和SeeDB37ht协议）以满足特定要求。
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