| Superresolution Microscopy of Drosophila Indirect Flight Muscle Sarcomeres
|
|
Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Sarcomeres are extremely highly ordered macromolecular assemblies where proper structural organization is an absolute prerequisite to the functionality of these contractile units. Despite the wealth of information collected, the exact spatial arrangement of many of the H-zone and Z-disk proteins remained unknown. Recently, we developed a powerful nanoscopic approach to localize the sarcomeric protein components with a resolution well below the diffraction limit. The ease of sample preparation and the near crystalline structure of the Drosophila flight muscle sarcomeres make them ...
[摘要] [摘要] 肉瘤是高度有序的大分子组装体，其中适当的结构组织是这些可收缩单位功能的绝对前提。尽管收集到大量信息，但许多H区和Z盘蛋白的确切空间排列最近未知的是，我们开发了一种强大的纳米方法来定位肌氨酸蛋白成分，其分辨率远低于衍射极限。样品制备的简便性和果蝇的近晶体结构 飞行肌肉瘤使其非常适合单分子定位显微镜检查和结构平均。我们的方法使我们能够以大约5-10 nm的准分子定位精度确定数十个H区和Z盘蛋白的位置。下文所述的协议为制备用于dSTORM成像的单个肌原纤维提供了一种简便且可重现的方法，此外还包括对定制的免费提供的软件工具箱的深入描述，以处理和定量分析原始定位数据。
[背景 ] 肉瘤的结构已通过X射线晶体学以及各种EM方法进行了详细研究，从而形成了来自许多物种的细丝和粗丝的准原子模型。尽管如此，这些检查取得了很好的结果对于肌动蛋白-肌球蛋白重叠区的了解，I带和H区复合物的空间排列仍是未知之数。荧光超分辨率显微镜（也称为纳米显微镜）的最新进展提供了远低于衍射极限的空间分辨率。值得注意的是，单分子定位显微镜（SMLM）可以非常高精度地提供多蛋白复合物的定位图，实际上达到了单个蛋白的大小分辨率（Sigal et al。，2018）。
...
|
|
|
| Production, Purification and Characterization of Recombinant Biotinylated Phytochrome B for Extracellular Optogenetics
|
|
Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] In the field of extracellular optogenetics, photoreceptors are applied outside of cells to obtain systems with a desired functionality. Among the diverse applied photoreceptors, phytochromes are the only ones that can be actively and reversibly switched between the active and inactive photostate by the illumination with cell-compatible red and far-red light. In this protocol, we describe the production of a biotinylated variant of the photosensory domain of A. thaliana phytochrome B (PhyB-AviTag) in E. coli with a single, optimized expression plasmid. We give detailed ...
[摘要] [摘要 ] 在细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，以获得具有所需功能的系统。在各种应用的感光体中，植物色素是唯一可以通过与细胞相容的红色和远红外光照射而在活性和非活性光态之间主动和可逆地切换的色素。在此协议中，我们描述了在大肠杆菌中拟南芥光敏色素B（PhyB-AviTag ）的光敏域的生物素化变体的生产。 带有一个优化的表达质粒。我们给出了通过固定的金属亲和色谱法纯化蛋白质的详细说明，并根据纯度，生物素化，光谱光开关以及与它的相互作用伴侣PIF6的光依赖性相互作用对蛋白质进行了表征。与以前使用PhyB-AviTag 进行的研究相比，此方案中使用的优化表达质粒简化了生产过程，并显示出更高的产量和纯度。
[背景 ] 在新兴的细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，例如，以控制生物功能或设计光响应性生物材料（Leung 等，2008；Zhang 等，2015；Chen and Wegner ，2017 ; Lyu 等人，2017 ; Wang 等人，2017 ; Bartelt 等人，2018 ; Beyer 等人，2018a ; Beyer 等人，2018b ; Jia 等人，2018 ; Kolar 等人， 2018 ; Liu 等人，2018 ; Wu 等人，2018 ; Baaske 等人，2019 ; Gil 等人，2019 ; H?rner ...
|
|
|
| In planta Transcriptome Analysis of Pseudomonas syringae
|
|
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Profiling bacterial transcriptome in planta is challenging due to the low abundance of bacterial RNA in infected plant tissues. Here, we describe a protocol to profile transcriptome of a foliar bacterial pathogen, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, in the leaves of Arabidopsis thaliana at an early stage of infection using RNA sequencing (RNA-Seq). Bacterial cells are first physically isolated from infected leaves, followed by RNA extraction, plant rRNA depletion, cDNA library synthesis, and RNA-Seq. This protocol is likely applicable not only to the A. ...
[摘要] 由于受感染植物组织中细菌RNA的丰度低，因此在植物中分析细菌转录组具有挑战性。 在这里，我们描述了一个描述叶子细菌病原体转录组的协议， Pseudomonas syringae pv。 番茄 DC3000，在感染早期的拟南芥叶中使用RNA测序（RNA-Seq）。 首先从感染的叶子中物理分离细菌细胞，然后进行RNA提取，植物rRNA消耗，cDNA文库合成和RNA-Seq。 该协议不仅适用于 A.拟南芥-P。 syringae 病理系统，但也适用于不同的植物 - 细菌组合。
【背景】植物已经进化出先天免疫系统以抵御病原体攻击。在过去的几十年中，已经深入研究了病原体识别和免疫信号传导途径的分子机制。然而，植物免疫如何影响病原体代谢以抑制病原体生长几乎不被理解，因为在植物中分析病原体反应很困难。在细菌病原体的情况下，植物叶内的转录组分析很难研究，因为细菌mRNA的量远低于植物的数量;由于植物中细菌的人口密度低，在感染的早期阶段尤其具有挑战性。为克服这一局限性，我们建立了一种从感染的植物叶片中分离细菌并用RNA-Seq分析细菌转录组的方法。该方法已成功用于分析模型细菌病原体 Pseudomonas syringae pv的转录组。 番茄 DC3000在模式植物 Arabidopsis thaliana 中的各种条件下（Nobori et al。，2018）. ...
|
|
|