| Generation of Gene Knockout and Gene Replacement with Complete Removal of Full-length Endogenous Transcript Using CRISPR-Trap
|
|
Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] This protocol describes the application of the CRISPR-Trap from designing of the gene targeting strategy to validation of successfully edited clones that was validated on various human cell lines, among them human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). The advantage of CRISPR-Trap over conventional approaches is the complete removal of any endogenous full-length transcript from the target gene. CRISPR-Trap is applicable for any target gene with no or little coding sequence in its first exon. Several human cell lines and different genes have so far been edited successfully with CRISPR-Trap.
[摘要] 该协议描述了CRISPR-Trap从设计基因靶向策略到验证成功编辑的克隆的应用，所述克隆在各种人细胞系上得到验证，其中人类诱导的多能干细胞（hiPSC）。 CRISPR-Trap优于常规方法的优点是从靶基因完全去除任何内源全长转录物。 CRISPR-Trap适用于在其第一个外显子中没有编码序列或编码序列很少的任何靶基因。 到目前为止，已经使用CRISPR-Trap成功编辑了几种人细胞系和不同基因。
【背景】CRISPR / Cas9技术的出现促进了基因敲除和基因编辑的基因组靶向。执行敲除的常规方法依赖于引入移码导致过早终止密码子（PTC），截短开放阅读框（ORF）以及随后通过无义介导的mRNA衰变（NMD）降解靶基因的转录物。 。这种方法的一个可能的缺陷是全长转录物，其可以逃避NMD并产生具有残余或甚至显性负功能的C末端截短蛋白。该协议提出了CRISPR-Trap，这是我们最近建立的一种方法（Reber et al。>，2018），成功编辑后将阻止从靶基因位点表达任何全长转录本（图1）。简而言之，这种方法针对CRISPR / ...
|
|
|
| Individual-nucleotide-resolution UV Cross-linking and Immunoprecipitation (iCLIP) of UPF1
|
|
Author:
Date:
2014-04-05
[Abstract] The fate of mRNA, in particular its stability, localization and rate of translation is regulated by RNA binding proteins assembling to messenger ribonucleoprotein (mRNP) complexes. To investigate the transcriptome-wide RNA binding sites of UPF1, the core factor of nonsense-mediated mRNA decay (NMD), we performed individual-nucleotide-resolution UV cross-linking and immunoprecipitation (iCLIP) (Zund et al., 2013) followed by high-throughput sequencing. The presented protocol is optimized to investigate the RNA-binding sites of UPF1 and is based on previously described studies (Konig et ...
[摘要] mRNA的命运，特别是其稳定性，定位和翻译速率由装配到信使核糖核蛋白（mRNP）复合物的RNA结合蛋白调节。 为了研究无义介导的mRNA衰变（NMD）的核心因子UPF1的转录组范围的RNA结合位点，我们进行单个核苷酸分辨率的UV交联和免疫沉淀（iCLIP）（Zund等，/em>，2013），然后进行高通量测序。 优化所提出的方案以研究UPF1的RNA结合位点并且基于先前描述的研究（Konig等人，2010; Konig等人，2011; Hafner等人，2010）。 我们要感谢Mihaela Zavolan（瑞士巴塞尔瑞士生物信息学研究所）和Jernej Ule（英国剑桥的分子生物学医学研究委员会实验室）组织这些实验的技术支持。
|
|
|