| Dual sgRNA-based Targeted Deletion of Large Genomic Regions and Isolation of Heritable Cas9-free Mutants in Arabidopsis
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] CRISPR/Cas9 system directed by a gene-specific single guide RNA (sgRNA) is an effective tool for genome editing such as deletions of few bases in coding genes. However, targeted deletion of larger regions generate loss-of-function alleles that offer a straightforward starting point for functional dissections of genomic loci. We present an easy-to-use strategy including a fast cloning dual-sgRNA vector linked to efficient isolation of heritable Cas9-free genomic deletions to rapidly and cost-effectively generate a targeted heritable genome deletion. This step-by-step protocol ...
[摘要] [摘要] CRISPR/Cas9由基因特异性单导RNA（sgRNA）引导的系统是一种有效的基因组编辑工具，如编码基因中少部分碱基的删除。然而，大区域的靶向缺失产生功能缺失等位基因，这为基因组基因座的功能解剖提供了一个直接的起点。我们提出了一个简单易用的策略，包括一个快速克隆双sgRNA载体，有效分离可遗传的Cas9游离基因组缺失，以快速且经济有效地产生靶向遗传基因组缺失。该方法包括拟南芥的gRNA设计、克隆策略和突变检测，可适用于其他植物。
[背景] ...
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| Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] With the recent implementation of the CRISPR/Cas9 technology as a standard tool for genome editing, laboratories all over the world are undergoing one of the biggest advancements in molecular biology since PCR. The key advantage of this method is its simplicity and universal applicability for species of any phylum. Of particular interest is the extensively studied Gram-negative bacterium Escherichia coli, as it is considered as the workhorse for both research and industrial purposes. Here, we present a simple, robust and effective protocol using the CRISPR/Cas9 system in combination ...
[摘要] 随着CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具的最近实施，全世界的实验室正在经历PCR以来分子生物学方面最大的进步之一。这种方法的关键优点是其简单和普遍适用于任何物种的门。特别感兴趣的是广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌，因为它被认为是研究和工业用途的主力。在这里，我们提出了一个简单，强大和有效的协议，使用CRISPR / Cas9系统结合λ红色基因敲除机器。大肠杆菌。在我们的程序中最重要的是使用双链供体DNA和固化策略来去除导向RNA编码质粒，其允许在仅仅两个工作日后开始新的突变。我们的方案允许多个具有高诱变效率的基因敲除株，适用于高通量的方法。
【背景】革兰氏阴性细菌大肠杆菌是生物技术工程中最重要的生物之一。已在能源，农业，食品生产，生物技术，医药等不同行业的各种流程中成功实施。由于不断的技术进步，生物技术部门正在迅速发展。特别是，CRISPR / Cas9技术可能是PCR（分子）生物学最大的革命（Ledford，2015）。简而言之，CRISPR / Cas9保护细菌免受诸如质粒和病毒等侵入性遗传因子的影响（Marraffini，2015）。利用这种从原核生物获得的免疫系统，已经开发了基于CRISPR / Cas9系统的基因组编辑的非常有力的工具（Jinek等人，2012）。
CRISPR / ...
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| CRISPR/Cas9 Gene Editing in the Marine Diatom Phaeodactylum tricornutum
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The establishment of the CRISPR/Cas9 technology in diatoms (Hopes et al., 2016; Nymark et al., 2016) enables a simple, inexpensive and effective way of introducing targeted alterations in the genomic DNA of this highly important group of eukaryotic phytoplankton. Diatoms are of interest as model microorganisms in a variety of areas ranging from oceanography to materials science, in nano- and environmental biotechnology, and are presently being investigated as a source of renewable carbon-neutral fuel and chemicals. Here we present a detailed protocol of how to perform ...
[摘要] 在硅藻（Hopes ，2016; Nymark等人，2016）中建立了CRISPR / Cas9技术，使得能够简单，廉价和有效地引入目标 这个非常重要的真核浮游植物群的基因组DNA的改变。 硅藻在纳米和环境生物技术领域从海洋学到材料科学，各种领域的示范性微生物都是有意义的，目前正在作为可再生碳中和燃料和化学品的来源进行调查。 在这里，我们提出了如何进行海洋硅藻三角褐指藻CRISPR / Cas9基因编辑的详细方案，包括：1）在硅藻优化的CRISPR / Cas9载体（pKS diaCas9）中插入引导RNA靶位点 -sgRNA），2）用于将pKS diaCas9-sgRNA质粒导入P的生物弹道转化。 三分支毛细胞和3）基于高分辨率熔融的PCR测定以筛选CRISPR / Cas9诱导的突变。
【背景】CRISPR / Cas9系统已被证明是许多真核生物中非常有效和成功的基因组编辑系统，现在也包括微藻（Hopes等人，2016; Nymark等人）。 ，2016; Shin 等人，2016）。 CRISPR / Cas9系统包括引导RNA（gRNA）和称为Cas9的核酸酶（Sander and Joung，2014）。 这两个分子形成复合物，其中gRNA将复合物引导至感兴趣的靶标。 ...
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