| Measurement of the Intracellular Calcium Concentration with Fura-2 AM Using a Fluorescence Plate Reader
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Intracellular calcium elevation triggers a wide range of cellular responses. Calcium responses can be affected or modulated by membrane receptors mutations, localization, exposure to agonists/antagonists, among others (Burgos et al., 2007; Martínez et al., 2016). Changes in intracellular calcium concentration can be measured using the calcium sensitive fluorescent ratiometric dye fura-2 AM. This method is a high throughput way to measure agonist mediated calcium responses.
[摘要] 细胞内钙升高引发广泛的细胞反应。 钙响应可能受到膜受体突变，定位，暴露于激动剂/拮抗剂等的影响或调节（Burgos et al。，2007;Martínez等人，2016年））。 细胞内钙浓度的变化可以使用钙敏感荧光比例染料fura-2 AM测量。 该方法是测量激动剂介导的钙反应的高通量方法。
【背景】G蛋白偶联受体的激活触发了数百或数千个第二信使分子的产生。一旦被刺激，G蛋白偶联受体激活磷脂酶C（PLC），其将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯（PIP 2 N）切割成二酰基甘油（DAG）和肌醇1 ，4,5-三磷酸酯（IP 3+）。 DAG保持膜结合，并且IP 3被释放到胞质溶胶中，其结合到内质网（ER）中的特异性IP 3'受体（钙通道）。这导致调节钙结合蛋白和蛋白激酶C（PKC）的激活的细胞内钙浓度的增加。因此，考虑到钙在生物系统中的重要性，已经建立了许多分析和测量Ca 2+水平的技术/方法。
＆NBSP;为确定细胞内Ca 2+浓度，荧光指示剂特别有用。 Ca 2 + 指示符可用于亲和力，亮度或光谱特性的变化。 Fura-2-乙酰氧基甲酯（fura-2 AM）是比例计算的钙指示剂fura-2的膜可渗透的非侵入性衍生物。 Fura-2 AM穿过细胞膜，一旦在细胞内，细胞酯酶除去乙酰氧基甲基。 Ca 2 + -bound fura-2 AM在335 ...
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| Single Cell Flow Cytometry Assay for Peptide Uptake by Bacteria
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Antimicrobial peptides (AMPs) can target the bacterial envelope or alternatively have intracellular targets. The latter requires uptake of the peptide by the bacterial cells. The bacterial internalization of an AMP can be evaluated by a fluorescence-based method that couples the use of the fluorescently labelled AMP to the fluorescence quencher trypan blue. Trypan blue is excluded from the interior of intact cells and the fluorescence of the extracellular peptide or of the peptide bound on the bacterial surface can be quenched by it, while the fluorescence of the internalized peptide is not ...
[摘要] 抗微生物肽（AMP）可靶向细菌包膜或者具有细胞内靶标。后者需要细菌细胞摄取肽。 AMP的细菌内化可以通过基于荧光的方法来评估，所述方法将荧光标记的AMP的使用耦合到荧光猝灭剂台盼蓝。台盼蓝从完整细胞的内部排除，并且细胞外肽或结合在细菌表面上的肽的荧光可被其淬灭，而内化肽的荧光不受影响。通过用流式细胞术测量单个细胞中的荧光来测定细菌对肽的吸收。
关键词：抗微生物肽，流式细胞术，肽摄取，肽转运蛋白，台盼蓝，碘化物吸收量
[背景] AMP由广泛且多样的有效抗微生物剂组成，具有作为新型治疗剂的潜力（Wang等人）。 ，2015）。 AMP是天然免疫的一部分并且由所有王国的生物产生。它们被这些生物体动员以抵抗感染的微生物，其可以是细菌，真菌或病毒。他们这样做通过直接杀死微生物，但他们也可以作为哨兵，促进其他免疫途径。有趣的是，还已经清楚的是，AMP不仅是针对不良微生物的药剂，而且它们还在动物和植物宿主中共生细菌群体的控制中具有关键作用（Maróti等人，2011 ; Kondorosi et al 。，2013）。
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| In vitro Real-time Measurement of the Intra-bacterial Redox Potential
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Author:
Date:
2015-09-05
[Abstract] All bacteria that live in oxygenated environments have to deal with oxidative stress caused by some form of exogenous or endogenous reactive oxygen species (ROS) (Imlay, 2013). Large quantities of ROS damage DNA, lipids and proteins which can eventually lead to bacterial cell death (Imlay, 2013). In contrast, smaller quantities of ROS can play more sophisticated roles in cellular signalling pathways affecting almost every process in the bacterial cell e.g. metabolism, stress responses, transcription, protein synthesis, etc. Previously, inadequate analytical methods prevented ...
[摘要] 所有存在氧合环境中的细菌都必须处理由某种形式的外源性或内源性活性氧（ROS）引起的氧化应激（Imlay，2013）。大量的ROS损伤DNA，脂质和蛋白质，其可以最终导致细菌细胞死亡（Imlay，2013）。相反，较少量的ROS可以在细胞信号传导途径中发挥更复杂的作用，影响几乎细菌细胞中的每一个过程，例如，代谢，应激反应，转录，蛋白质合成等 。以前，不充分的分析方法阻止了细菌内氧化还原电位的适当分析。在本文中，我们描述了使用氧化还原敏感性GFP（roGFP2）测量细菌内氧化还原电位的实时变化的方法（van der Heijden等人，2015）。 roGFP2蛋白被工程改造成含有特定的半胱氨酸残基，其在氧化时形成内部二硫键，导致蛋白构象的轻微改变（Hanson等人，2004）。这种移位导致两种不同的蛋白质同种型在分别在405nm和480nm下激发后具有不同的荧光激发光谱。因此，相应的405/480nm比率可以用作细菌内氧化还原电位的量度。比率量度分析排除了由于roGFP2浓度差异引起的变化，并且由于构象变化是可逆的，因此系统允许测量氧化以及还原条件。在该方案中，我们通过测量鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌）内的细菌内氧化还原电位来描述该系统，但该系统可以调整用于其他革兰氏阴性菌。
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