Analyzing (Re)Capping of mRNA Using Transcript Specific 5' End Sequencing
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] The 5′ cap is a ubiquitous feature of eukaryotic mRNAs. It is added in the nucleus onto newly synthesized pre-mRNA, and in the cytoplasm onto mRNAs after decapping or endonuclease cleavage. Cytoplasmic recapping can occur after loss of the cap at the native 5′ end, or downstream within the body of the mRNA. The identification and location of recapping events is key to understanding the functional consequences of this process. Here we present an approach that addresses this problem, using the Lexogen TeloPrime® cDNA synthesis kit to tag recapped 5′ ends. TeloPrime uses a proprietary ...
[摘要] [摘要]5′cap是真核mRNAs普遍存在的特征。它被添加到新合成的pre-mRNA的细胞核中,并在去盖或核酸内切酶切割后加入到mRNAs的细胞质中。细胞质重拾可发生在5′端或mRNA体下游的cap缺失后。识别和定位重述事件是理解该过程的功能后果的关键。这里我们提出了一种解决这个问题的方法,使用Lexogen TeloPrime®cDNA合成试剂盒来标记重述的5′端。TeloPrime使用一种专有的DNA连接酶,在cDNA的3′端加入一个双链DNA寡核苷酸,同时与mRNA碱基配对。寡核苷酸在mRNA 5′端有一个与m7G弱碱基配对的不成对C残基。然后用引物对附加的寡核苷酸和感兴趣的mRNA进行双链cDNA的PCR扩增。得到的产物是凝胶纯化和直接测序(如果是单个带)或克隆和测序。连接的寡核苷酸和靶mRNA连接处的序列提供了cap在相应转录物上的位置。此方法适用于所有封顶转录本。它可以与Sanger测序一起用于少量的转录物,也可以用于Illumina库测序。 [背景]N7-甲基鸟苷帽是所有真核mRNAs的一个显著特征。与cap结合的蛋白质在mRNA生命周期的各个阶段发挥作用,包括核加工、输出、翻译和mRNA衰变。5′cap以共转录方式添加到所有mRNAs中,并开发了许多全基因组技术(例如,基因表达的Capped分析,或CAGE)(Morioka等人,2020年),这些技术利用末端末端的鉴定来标记转录起始位点。除了标记转录起始位点外,约25%的笼状标签映射到剪接内含子的下游(Djebali等人,2012年)。生物化学基础的证据来自我们实验室2009年的鉴定:一种细胞质复合体能够将N7甲基鸟苷帽恢复到5′-单磷酸末端的转录物上,但不能恢复到5′-羟基末端的转录物上(Otsuka等人,2009年)。细胞质封顶由一种复合酶催化,包括封盖酶(RNGTT)、帽甲基转移酶(RNMT)及其激活亚单位(RAM),以及一种将去盖转录物的5′-单磷酸末端转化为5′-二磷酸底物以进行GMP添加的激酶(Trotman和Schoenberg,2019)。我们的早期工作是基于在GMP添加步骤中阻断细胞质封盖的显性负型封盖酶的使用。该蛋白的表达导致出现许多未封顶的转录本,其末端使用5'-种族定位到下游笼状标签附近(Kiss等人,2015年;Berger等人,2019年)。虽然令人鼓舞,但这种方法有三个主要缺点:a)它需要分离带帽和未封顶的rna,b)它假设未封顶的转录本保持足够稳定,可以被检测到,以及c)它假设以这种方式检测到的未封顶末端经历了有限的额外的核外溶核修剪。 ...
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An in vitro DNA Sensor-based Assay to Measure Receptor-specific Adhesion Forces of Eukaryotic Cells and Pathogens
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Motility of eukaryotic cells or pathogens within tissues is mediated by the turnover of specific interactions with other cells or with the extracellular matrix. Biophysical characterization of these ligand-receptor adhesions helps to unravel the molecular mechanisms driving migration. Traction force microscopy or optical tweezers are typically used to measure the cellular forces exerted by cells on a substrate. However, the spatial resolution of traction force microscopy is limited to ~2 µm and performing experiments with optical traps is very time-consuming. Here we present the ...
[摘要] [摘要 ] 组织内真核细胞或病原体的运动性是通过与其他细胞或细胞外基质特异性相互作用的转换来介导的。这些配体-受体粘附的生物物理特征有助于揭示驱动迁移的分子机制。牵引力显微镜或光学镊子通常用于测量细胞在基质上施加的细胞力。但是,牵引力显微镜的空间分辨率仅限于〜2 µm,使用光阱进行实验非常耗时。
在这里,我们介绍了仿生表面的生产,该表面能够通过合成配体实现特定的细胞粘附,同时通过使用分子张力传感器监控传递的力。将配体与双链DNA探针偶联,该探针具有确定的DNA解链力阈值。从而将pN范围内的受体介导力半定量转换为荧光信号,可以通过标准荧光显微镜在分辨率极限(〜0.2 µm)上检测到。
该测定的模块化设计允许改变所呈现的配体和DNA探针的机械强度,这为探测不同的真核细胞类型和病原体的粘附提供了多种可能性,此处以骨肉瘤细胞和伯氏疟原虫子孢子体为例。
[背景 ] 运动细胞和病原体以多种不同方式与环境相互作用(Parsons 等,2010; Nan ,2017; Muthinja 等,2018 )。例如,跨膜受体将单个细胞锚定在其环境中,并使其与其他细胞相互作用(Hynes ,1992)。整联蛋白是将细胞连接到细胞外基质的主要受体,它以双向方式传递力(Schoen et ...
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The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines
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Date:
2018-05-05
[Abstract] Autophagy is a key player in the maintenance of cellular homeostasis in eukaryotes, and numerous diseases, including cancer and neurodegenerative disorders, are associated with alterations in autophagy. The interest for studying autophagy has grown intensely in the last two decades, and so has the arsenal of methods utilised to study this highly dynamic and complex process. Changes in the expression and/or localisation of autophagy-related proteins are frequently assessed by Western blot and various microscopy techniques. Such analyses may be indicative of alterations in autophagy-related ...
[摘要] 自噬是维持真核生物细胞稳态的关键因素,包括癌症和神经退行性疾病在内的许多疾病都与自噬的改变有关。研究自噬的兴趣在过去的二十年里急剧增长,并且还有用于研究这种高度动态和复杂过程的方法库。通常通过Western印迹和各种显微镜技术来评估自噬相关蛋白的表达和/或定位中的变化。这样的分析可能表明自噬相关过程的改变,并且关于正在研究的特定标记物的信息。然而,由于这些蛋白质是自噬机制的一部分,而不是自噬性货物,所以它们不能用于得出关于自噬载货流量的结论。在这里,我们提供了一个协议,通过使用长寿命的蛋白质降解测定来定量评估体积自噬流量。我们的程序追踪14 C缬氨酸标记的蛋白质的降解是简单和快速的,允许并行处理相对大量的样品,并且原则上可以与任何贴壁细胞一起使用线。最重要的是,它可以通过自噬途径定量测量内源货物流量。因此,它是研究自噬活动的黄金标准之一。
【背景】脉冲追踪标记方法已用于研究蛋白质周转数十年。在此处描述的长寿命蛋白质降解(LLPD)测定中,培养细胞的蛋白质组用14 ...
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