| Expression and Analysis of Flow-regulated Ion Channels in Xenopus Oocytes
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Mechanically-gated ion channels play key roles in mechanotransduction, a process that translates physical forces into biological signals. Epithelial and endothelial cells are exposed to laminar shear stress (LSS), a tangential force exerted by flowing fluids against the wall of vessels and epithelia. The protocol outlined herein has been used to examine the response of ion channels expressed in Xenopus oocytes to LSS (Hoger et al., 2002; Carattino et al., 2004; Shi et al., 2006). The Xenopus oocyte is a reliable system that allows for the ...
[摘要] 机械门控离子通道在机械传导中起关键作用，这是将物理力量转化为生物信号的过程。 上皮细胞和内皮细胞暴露于层流剪切应力（LSS），这是通过流体流向血管壁和上皮细胞壁所施加的切向力。 本文概述的方案已用于检查在非洲爪蟾卵母细胞中表达的离子通道对LSS的反应（Hoger等，2002; Carattino等，2004; Shi等，2006）。 非洲爪蟾卵母细胞是允许离子通道和调节蛋白的表达和化学修饰的可靠系统（George等，1989; Palmer等，1990; Sheng等，2001; Carattino等，2003）。 因此，该技术适用于研究允许流激活通道响应LSS的分子机制。
【背景】排列血管的泌尿道和内皮细胞的上皮细胞经受移动流体引起的机械力。这些力是层流剪切应力（LSS），与管状结构壁相切的摩擦力，以及垂直于流动方向的周向拉伸。令人信服的证据表明，LSS是响应肾和血管管状结构的流动变化而观察到的生理反应的主要决定因素（Satlin等，2001; Liu等，2003; Weinbaum等，2010） 。在这些设置中，离子通道具有将流体剪切应力传递到生物信号中的重要作用（Ranade等，2015）。例如，在肾的远端肾单位中，Na +再吸收和K ...
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| In vivo Live Imaging of Calcium Waves and Other Cellular Processes during Fertilization in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Fertilization calcium waves are a conserved trigger for animal development; however, genetic analysis of these waves has been limited due to the difficulty of imaging in vivo fertilization. Here we describe a protocol to image calcium dynamics during in vivo fertilization in the genetic animal model Caenorhabditis elegans. This protocol consists of germline microinjection of a chemical calcium indicator, worm immobilization, live imaging, and image processing that quantifies the calcium fluorescence in the oocyte region moving in the field-of-view during ovulation. ...
[摘要] 受精钙波是动物发育的保守触发因素; 然而，这些波的遗传分析由于在体内成像难以受精而受到限制。 在这里，我们描述了在遗传动物模型秀丽隐杆线虫中的体内受精期间成像钙动力学的方案。 该方案包括化学钙指示剂的种系显微注射，蠕虫固定，活体成像和图像处理，其量化在排卵期间在视野内移动的卵母细胞区域中的钙荧光。 该成像方案也可以用于在体内受精期间对其他细胞过程进行成像。 线虫，如膜融合和细胞骨架动力学。
受精钙波在卵活化中起关键作用，并通过使用体外施肥系统在各种生物体中进行了分析。 线虫秀丽隐杆线虫由于其半透明的身体，适合于在体内成像受精。 受精钙成像在C. 塞缪尔等人报道了使用化学钙指示剂的线虫。 （2001）。 我们在这里描述了通过应用高速旋转盘共焦显微镜和图像处理方法从成像方法修改的方案，其在排卵期间分割在视场中移动的受精卵母细胞区域。 该协议能够精确定量描述钙波的时间动力学和波形图的遗传分析。
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| A Co-culture Model for Determining the Target Specificity of the de novo Generated Retinal Ganglion Cells
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In glaucoma, the output neurons of the retina, the retinal ganglion cells (RGCs), progressively degenerate, leading to irreversible blindness (Ahram et al., 2015). The ex vivo stem cell method to replace degenerated RGCs remains a potentially viable approach (Levin et al., 2004). However, the success of the approach depends upon the ability of the de novo generated RGCs to connect over the long distance with specific targets in the central visual pathway. Here, we describe a protocol to examine the target specificity of the de novo generated RGCs ...
[摘要] 在青光眼中，视网膜的输出神经元，视网膜神经节细胞（RGC）逐渐退化，导致不可逆的失明（Ahram等人，2015）。 替代退化RGCs的离体干细胞方法仍然是潜在可行的方法（Levin等人，2004）。 然而，该方法的成功取决于生成RGC的远程连接与中心视觉通路中特定目标的能力。 在这里，我们描述了一种协议，用于使用共培养方法来检查产生RG的产生RGCs的靶特异性，其中RGCs神经突被允许在特异性（上丘（SC））和非特异性 （下丘，IC）构造目标。
青光眼是全球不可逆失明的最常见原因之一（Tham等人，2014）。其特征在于RGC的进行性退化，视网膜的主要输出神经元，其与大脑连接用于视觉感知。不幸的是，目前尚无治疗RGCs变性的治疗方法。无论是外科手术，药理学还是神经保护，管理方法都不能扭转退行性变化（Danesh-Meyer，2011）。鉴于这种棘手的情况，干细胞治疗已经成为替代死亡RGCs的潜在可行方法。这种方法的成功需要：1）功能性和非致瘤性RGC与多能干细胞的定向分化，以及2）产生RGC的新生靶标特异性。我们的实验室最近展示了一种化学定义的方法，通过重述发育机制（Teotia等人，2016），允许RGCs从胚胎干（ES）/诱导的多能干细胞（iPS）细胞中的定向分化。所得的RGC是稳定的，功能性的和非致瘤性的。然而，远离干细胞在青光眼RGC变性中的生物细胞的成功取决于它们的轴突在中心视觉途径中找到适当靶标的能力。移植后，RGC的轴突必须在视网膜内导航，作为视神经退出，决定在视交叉处交叉或不交叉，并达到建立视网膜连接的具体目标。我们已经证明ES ...
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