| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of ...
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| Activity-based Pull-down of Proteolytic Standard and Immunoproteasome Subunits
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Activity-based probes (ABP) are small organic molecules that irreversibly bind to the active center of a specific enzyme family and may be coupled to a fluorophore or an affinity tag (Li et al., 2013). Here, we describe a method to pull-down active catalytic standard and immunoproteasome subunits in cell lysates using the biotinylated, proteasome-specific ABP Biotin-Epoxomicin (Bio-EP). Covalent labeling of the active catalytic subunits with Bio-EP is followed by a pull-down using streptavidin-coated beads. After elution from the beads, enriched subunits may be detected via Western ...
[摘要] 基于活性的探针（ABP）是不可逆地结合特定酶家族的活性中心并且可以偶联至荧光团或亲和标签的小有机分子（Li等人，2013）。在这里，我们描述了使用生物素化的蛋白酶体特异性ABP生物素 - 环氧丙素（Bio-EP）在细胞裂解物中下拉活性催化标准和免疫蛋白酶体亚基的方法。用Bio-EP共价标记活性催化亚单位，然后使用链霉抗生物素蛋白包被的珠子进行下拉。从珠中洗脱后，可以通过Western印迹，串联质谱法（Li et al。，2013）或其他技术检测富集的亚单位。
背景 蛋白酶体是存在于真核细胞的细胞核和细胞质中的桶形多分子酶复合物。蛋白质降解是重要的，包括加工MHC I呈递的抗原肽，并调节许多细胞过程（Kammerl和Meiners，2016）。在造血起源的细胞中，标准（组成型）蛋白酶体通常被免疫蛋白酶体（Meiners等人，2014）所替代，其在三种不同的催化活性β-亚基的掺入中不同（图1）。
为了研究单个催化亚基的分子功能并调节生理过程，亚基特异性蛋白酶体抑制剂的发展是必不可少的。 de ...
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| Seed Storage Reserve Analysis
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Author:
Date:
2014-10-20
[Abstract] One of the major goals of plant research is to improve crop yield, by for instance increasing seed oil or protein content. Besides this, extensive research is done to change seed fatty acid (FA) composition in order to make vegetable oils more suitable for specific purposes. To determine the effect of genetic changes on seed FA composition, oil, protein and sugar content it’s important to use standardised protocols to compare results between different research groups. Here we describe standardised methods for the analysis of seed FA composition, oil, protein and sugar content.
[摘要] 植物研究的主要目标之一是通过例如增加种子油或蛋白质含量来改善作物产量。 除此之外，还进行了广泛的研究以改变种子脂肪酸（FA）组成，以使植物油更适合于特定目的。 为了确定遗传变化对种子FA组成，油，蛋白质和糖含量的影响，使用标准化方案来比较不同研究组之间的结果是重要的。 在这里我们描述标准化的方法，用于分析种子FA组成，油，蛋白质和糖含量。
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