| Super-resolution Imaging of the T cell Central Supramolecular Signaling Cluster Using Stimulated Emission Depletion Microscopy
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Supramolecular signaling assemblies are of interest for their unique signaling properties. A µm scale signaling assembly, the central supramolecular signaling cluster (cSMAC), forms at the center interface of T cells activated by antigen presenting cells (APC). The adaptor protein linker for activation of T cells (LAT) is a key cSMAC component. The cSMAC has widely been studied using total internal reflection fluorescence microscopy of CD4+ T cells activated by planar APC substitutes. Here we provide a protocol to image the cSMAC in its cellular context at the interface between a T cell and ...
[摘要] [摘要]超分子信号组装体因其独特的信号传导特性而受到关注。在抗原呈递细胞（APC）激活的T细胞的中心界面处形成一个微米级的信号传导组件，即中央超分子信号簇（cSMAC ）。用于激活T细胞（LAT）的衔接子蛋白接头是关键的cSMAC组件。所述CSMAC已被广泛使用的CD4全内反射荧光显微镜研究+由平面APC替代活化的T细胞。在这里，我们提供了一种协议，可以在T细胞和APC之间的接口在其细胞上下文中成像cSMAC 。超分辨率激发发射耗尽显微镜（STED）用于确定LA T的定位，其活性，磷酸化形式及其整个池的位置。在固定和抗体染色之前，将载有激动剂肽的APC与TCR转基因CD4 + T细胞孵育4.5分钟。固定的细胞对在Leica SP8 AOBS共聚焦激光扫描显微镜上使用100x 1.4 NA物镜成像。LAT聚集在多个超分子复合物中，并确定了它们的数量和大小分布。使用此协议，可以量化在T细胞和APC之间的界面在其细胞环境中的cSMAC属性。
[背景] ...
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| Immunohistochemical Identification of Human Skeletal Muscle Macrophages
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Author:
Kate Kosmac, Bailey D. Peck, R. Grace Walton, Jyothi Mula, Philip A. Kern, Marcas M. Bamman, Richard A. Dennis, Cale A. Jacobs, Christian Lattermann, Darren L. Johnson and Charlotte A. Peterson,
Date:
2018-06-20
[Abstract] Macrophages have well-characterized roles in skeletal muscle repair and regeneration. Relatively little is known regarding the role of resident macrophages in skeletal muscle homeostasis, extracellular matrix remodeling, growth, metabolism and adaptation to various stimuli including exercise and training. Despite speculation into macrophage contributions during these processes, studies characterizing macrophages in non-injured muscle are limited and methods used to identify macrophages vary. A standardized method for the identification of human resident skeletal muscle macrophages will aide ...
[摘要] 巨噬细胞在骨骼肌修复和再生中具有很好的特征。关于驻留巨噬细胞在骨骼肌动态平衡，细胞外基质重塑，生长，代谢和适应各种刺激（包括运动和训练）中的作用知之甚少。尽管在这些过程中推测了巨噬细胞的贡献，但表征非受伤肌肉中的巨噬细胞的研究是有限的，用于鉴定巨噬细胞的方法各不相同。用于鉴定人类骨骼肌巨噬细胞的标准化方法将有助于鉴定这些免疫细胞，并可用于各研究结果的比较。在这里，我们提出免疫组织化学（IHC）协议，通过流式细胞术验证，以清楚地识别常驻人类骨骼肌巨噬细胞种群。我们显示CD11b和CD206双IHC有效识别人骨骼肌中的巨噬细胞。此外，非受伤人骨骼肌中的大多数巨噬细胞表现出“混合”M1 / M2表型，表达CD11b，CD14，CD68，CD86和CD206。在休息的骨骼肌中存在相对较少的CD11b + / CD206-巨噬细胞群。这种人口的相对丰度的变化可能反映了骨骼肌肉环境的重要变化。肌肉中的CD11b和CD206 IHC也显示出巨噬细胞的不同形态学特征，这些特征可能与这些细胞的功能状态有关。
【背景】巨噬细胞是能够适应局部微环境变化的多向性免疫细胞。在过去几年中，研究表明巨噬细胞表型是动态的，存在于连续统一体中（Mosser and Edwards，2008，Italiani and Boraschi，2014，Martinez and ...
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| Expansion of Airway Basal Cells and Generation of Polarized Epithelium
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Airway basal stem cells are the progenitor cells within the airway that exhibit the capacity to self-renew and give rise to multiple types of differentiated airway epithelial cells. This stem cell-derived epithelium displays organized architecture with functional attributes of the airway mucosa. A protocol has been developed to culture and expand human airway basal stem cells while preserving their stem cell properties and capacity for subsequent mucociliary differentiation. This achievement presents a previously unrealized opportunity to maintain a durable supply of progenitor cells derived ...
[摘要] 气道基底干细胞是气道内的祖细胞，表现出自我更新的能力并产生多种类型的分化的气道上皮细胞。这种干细胞来源的上皮细胞显示出具有气道粘膜功能属性的有组织的结构。已经开发了一种方案来培养和扩展人气道基底干细胞，同时保持其干细胞特性和后续粘液分泌的能力。这项成就提供了一个以前未实现的机会，以保持源自健康供体的祖细胞的持久供应，以分化为用于基于细胞和分子的研究的人原发性气道上皮。此外，基底干细胞可以从患有特定气道疾病的患者（例如囊性纤维化）中收集，从而能够在适当的气道粘膜环境下研究疾病特异性细胞的潜在改变的行为。在这里，我们详细描述了一系列气道基底干细胞系列扩增的方案，以实现几乎无限制的气道基底细胞的生成，这些细胞可以储存并随时用于随后的培养和分化。此外，我们描述了气液基底干细胞在空气 - 液体界面处的可渗透Transwell过滤器上的培养和分化，以创建功能性粘膜睫毛伪分层极化气道上皮粘膜。
【背景】气道疾病建模和药物发现已经从在气液界面（ALI）的可渗透Transwell过滤器上生长的原代呼吸道上皮培养物的开发和使用中获益。与永生化细胞系相比，该模型具有几个优点，即原代上皮细胞可以分化成具有多种上皮细胞类型（包括纤毛，浆膜和基底细胞）的气道粘膜，并且它们的排列在体内是相当反映的蜂窝组织。主要的ALI模型表现出功能性微生理过程，包括跳动纤毛和分泌粘液的能力，这些特征在细胞系衍生的上皮单层中显着不存在。此外，原代细胞不依赖于人工永生化或转化，因为细胞系来源的上皮细胞确实存在，因此不受细胞系中可能发生的错误信号传导的阻碍，这可能会错误地表示气道上皮中发生的过程。尽管有这些显着的限制，永生化细胞系被广泛用于模拟和研究气道上皮细胞，因为原发性气道上皮细胞存在自己的一系列挑战。原代上皮细胞在传代数次后无法复制，必须连续收获并分离以完成每组研究。另外，改变或缺失感兴趣基因表达的分子生物学技术难以实现，并且与原代上皮细胞一起维持。这些缺点造成成本和技术障碍，阻碍了原发性ALI培养物的广泛使用，尽管它们在调查气道粘膜方面有明显优势。 ...
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