| Dual Fluorescence Cytometry Assay to Assess Cellular Protein Levels
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Expression levels of cellular proteins can be affected by various perturbations, such as genetic knockout of interactors, drug treatments or cell stress. To specifically measure the effects on protein levels post-synthesis under different experimental conditions, it is important to compensate for transcriptional and other upstream changes. Here, we provide a protocol for a dual-fluorescence flowcytometry-based assay to determine protein levels. The protein of interest is genetically linked to enhanced GFP (eGFP) followed by a viral 2A self-cleaving peptide sequence and mCherry. As a result, ...
[摘要] [摘要 ] 表达水平的细胞蛋白质可受各种扰动，如基因敲除交互件，药物治疗小号或细胞压力。具体测量对蛋白质水平合成后在不同的实验条件，重要的是要补偿对于转录等上游的变化在这里，我们提供了一个协议为双- 荧光流。流式细胞仪为基础的检测，以确定蛋白质水平目的蛋白是遗传关联增强GFP（EGFP 其次是病毒2A自身切割肽）序列和mCherry结果，报告子构建体的翻译会导致来自同一mRNA模板的两个荧光蛋白产物，这使得能够进行明确的蛋白表达分析，并对整个样品进行归一化处理。
背景 ] 合成和维护的Cellu 拉尔在p- Roteins取决于多进程，从转录调节，处理和降解mRNA中翻译，折叠，本地化，翻译后修饰和蛋白质降解（沃格尔而且马科特，2012） 。具体研究的。在蛋白水平合成后的细胞扰动的影响，这一点很重要，以弥补变异上游步骤蛋白表达在这里，我们提供了一个协议的双- 荧光流术为基础的检测，以确定蛋白质水平处于稳定状态如前所述（Itakura 等人，2016; Chitwood 等人，2018; Ngo 等人，2019）。目的蛋白在基因上与增强的GFP（eGFP ）融合，随后是病毒2A自切割肽序列和一个第二种荧光蛋白，mCherry （图1），由于在2A s时核糖体跳过了肽键，融合构建体的翻译产生了两种蛋白质产物，其比例为1：1。ite：与eGFP 和mCherry ...
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| Tracking Endocytosis and Intracellular Trafficking of Epitope-tagged Syntaxin 3 by Antibody Feeding in Live, Polarized MDCK Cells
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The uptake and trafficking of cell surface receptors can be monitored by a technique called ‘antibody-feeding’ which uses an externally applied antibody to label the receptor on the surface of cultured, live cells. Here, we adapt the traditional antibody-feeding experiment to polarized epithelial cells (Madin-Darby Canine Kidney) grown on permeable Transwell supports. By adding two tandem extracellular Myc epitope tags to the C-terminus of the SNARE protein syntaxin 3 (Stx3), we provided a site where an antibody could bind, allowing us to perform antibody-feeding experiments on cells with ...
[摘要] 细胞表面受体的摄取和贩卖可以通过被称为“抗体 - 进纸”技术，其在外部使用上应用的抗体来标记培养的活细胞的表面上的受体进行监测。在这里，我们适应传统的抗体喂养实验极化上皮细胞（Madin-Darby犬肾）生长在透性transwell支持。通过添加两个串联胞外Myc表位标签的SNARE蛋白突触3（Stx3）的C末端，我们提供了一种站点，其中与抗体可以结合，使我们能够用不同的顶端和基底外侧膜对细胞进行抗体 - 喂养实验。通过这个程序，我们观察到Stx3的内吞和细胞内运输。具体而言，我们评估从基底外侧膜Stx3的内在化速率和在时间和空间上使用固定在不同时间点的细胞免疫荧光显微镜随后的内吞观察路径。为此，介绍了以下可追踪单层的贩运行为：来自限制膜的靶蛋白。
【背景】SNARE蛋白突触3（Stx3）是已知的建立在极化上皮细胞顶端 - 基底极性（低等人，1996年Delgrossi 等人，1997年Weimbs 等人，1997;低等人，1998;黎等人，2002;低等人
一个典型的12孔细胞培养皿的阱内的transwell小室的聚碳酸酯膜的细胞培养插入物的图1示意图。斯特朗细胞是在膜的顶部和培养将形成紧密的单层做密封关聚碳酸酯膜将顶端介质隔室与基底外侧介质隔室分开。 ...
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| Determining the Relative Fitness Score of Mutant Viruses in a Population Using Illumina Paired-end Sequencing and Regression Analysis
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Author:
Date:
2015-05-20
[Abstract] Recent advances in DNA sequencing capacity to accurately quantify the copy number of individual variants in a large and diverse population allows in parallel determination of the phenotypic effects caused by each genetic modification. This systematic profiling approach is a combination of forward and reverse genetics, which we refer to as quantitative high-resolution genetics (qHRG). This protocol describes how to determine the relative fitness score of each variant compared to wild type (WT) virus based on its frequency determined by Illumina sequencing. Random mutagenesis techniques will be ...
[摘要] DNA测序能力的最近进展，准确量化大和多样群体中单个变体的拷贝数允许平行测定由每个遗传修饰引起的表型效应。这种系统分析方法是正向和反向遗传学的组合，我们称之为定量高分辨率遗传学（qHRG）。该方案描述了如何基于其通过Illumina测序确定的频率来确定每个变体与野生型（WT）病毒相比的相对适合度评分。随机诱变技术将用于在目标区域的每个密码子位置引入随机化，从而产生在每个感兴趣位置具有取代的综合输入突变文库（Qi等人，2014; Wu 等人，2014a; Wu ，2014b）。选择后，每个选定的文库将通过Illumina配对末端测序进行测序，并且确定每个突变的频率。基于频率的变化，可以用回归分析计算每个突变体的相对适合度分数。
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