| Reduced Representation Bisulfite Sequencing in Maize
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] DNA methylation is an epigenetic modification that regulates plant development (Law and Jacobsen, 2010). Whole genome bisulfite sequencing (WGBS) is a state-of-the-art method for profiling genome-wide methylation patterns with single-base resolution (Cokus et al., 2008). However, for an organism with a large genome, e.g., the 2.1 Gb genome of maize, WGBS may be very expensive. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) has been developed in mammalian studies (Smith et al., 2009). By digesting the genome with MspI with a size selection range of ...
[摘要] DNA甲基化是调节植物发育的表观遗传修饰（Law and Jacobsen，2010）。全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）是用单碱基分辨率分析全基因组甲基化模式的最先进的方法（Cokus et al。，2008）。然而，对于具有大基因组的生物体，例如玉米的2.1Gb基因组，WGBS可能非常昂贵。代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）已经在哺乳动物研究中发展（Smith等人，2009）。通过用大小选择范围大约40-220bp的 Msp 消化基因组，可以对仅涵盖〜1％人类基因组的CG富含区域进行特异性测序。然而，与哺乳动物基因组不同，植物基因组不显示清楚的CpG岛。因此原来的RRBS协议不适用于工厂。因此，我们开发了一种计算机管道来选择特定的酶以生成感兴趣区域（ROI） - 富集的，例如，富含启动子的，减少的植物表达基因组（例如， Hsu et al。，2017）。通过用MseI消化玉米基因组并选择40-300bp片段，我们测序了大约四分之一的玉米基因组，同时保留了84.3％的启动子信息。该协议已在玉米中成功建立，可广泛应用于任何基因组。我们的计算机管道系统与RRBS文库制备方案相结合，允许进行计算分析和实验验证。
【背景】DNA甲基化是一种可遗传的表观遗传修饰，通过调节基因表达和染色质结构在动物，植物和真菌的许多发育过程中发挥重要作用（Law and ...
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| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
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2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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| Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis
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Author:
Date:
2015-11-20
[Abstract] While telomerase is expressed in ~90% of primary human tumors, most somatic tissue cells except transiently proliferating stem-like cells do not have detectable telomerase activity (Shay and Wright, 1996; Shay and Wright, 2001). Telomeres progressively shorten with each cell division in normal cells, including proliferating stem-like cells, due to the end replication (lagging strand synthesis) problem and other causes such as oxidative damage, therefore all somatic cells have limited cell proliferation capacity (Hayflick limit) (Hayflick and Moorhead, 1961; Olovnikov, 1973). The progressive ...
[摘要] 虽然端粒酶在约90％的原发性人类肿瘤中表达，但除了瞬时增殖的干细胞样细胞之外，大多数体细胞组织细胞不具有可检测的端粒酶活性（Shay和Wright，1996; Shay和Wright，2001）。由于末端复制（滞后链合成）问题和其它原因例如氧化损伤，端粒在正常细胞中的每个细胞分裂（包括增殖的干细胞样细胞）逐渐缩短，因此所有体细胞具有有限的细胞增殖能力（Hayflick极限） （Hayflick和Moorhead，1961; Olovnikov，1973）。渐进性端粒缩短最终导致正常细胞中的生长停滞，其被称为复制衰老（Shay等人，1991）。一旦端粒酶在癌细胞中被激活，通过在染色体末端添加TTAGGG重复来稳定端粒长度，从而使细胞分裂无限延续（Shay和Wright，1996; Shay和Wright，2001）。因此，衰老和癌症之间的联系可以部分地解释端粒生物学。有许多快速和方便的方法来研究端粒生物学，例如端粒限制性片段（TRF），端粒重复扩增方案（Telomere Repeat Amplification Protocol， TRAP）（Mender and Shay，2015b）和端粒功能障碍诱导Foci（TIF）分析 ...
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