| Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC ...
[摘要] 对于疾病和基础科学研究而言，功能丧失（LOF）突变是非常重要的。 在这里，我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列，通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞，规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外，我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。
【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞（iPSC）的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而，使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA（gRNA）转染细胞，然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是，iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难，但仍然充满昂贵的设备（低氧培养箱），困难的技术步骤（FACS分选的单个iPSC的存活）或劳动密集型方案（亚克隆）（Forsyth ，2006; Miyaoka ...
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| Targeted Genome Editing of Virulent Phages Using CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol describes a straightforward method to generate specific mutations in the genome of strictly lytic phages. Briefly, a targeting CRISPR-Cas9 system and a repair template suited for homologous recombination are provided inside a bacterial host, here the Gram-positive model Lactococcus lactis MG1363. The CRISPR-Cas9 system is programmed to cleave a specific region present on the genome of the invading phage, but absent from the recombination template. The system either triggers the recombination event or exerts the selective pressure required to isolate recombinant phages. ...
[摘要] 该协议描述了一个直接的方法来产生严格裂解噬菌体的基因组中的特定突变。 简而言之，在细菌宿主（此处为革兰氏阳性模型乳酸乳球菌MG1363）内提供靶向CRISPR-Cas9系统和适合于同源重组的修复模板。 CRISPR-Cas9系统被编程为切割入侵噬菌体的基因组上存在的特定区域，但是缺少重组模板。 该系统触发重组事件或施加分离重组噬菌体所需的选择性压力。 利用这种方法，我们在毒性乳酸球菌噬菌体p2的基因组中产生了多个基因敲除，点突变和插入。 考虑到本协议中使用的质粒的广泛宿主范围，后者可以外推到其他噬菌体 - 宿主对。
【背景】噬菌体是在每个生态系统中发现丰富的细菌病毒（Suttle，2005; Breitbart and Rohwer，2005），毫不奇怪，它们是牛奶的天然居民。噬菌体p2是乳品工业中发现的强毒乳球菌噬菌体的最普遍组（ Sk1virus ）的模型（Deveau等人，2006; Mahony等人。，2012），它感染革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌MG1363，也是基础研究的模式菌株。尽管p2作为参照噬菌体的地位，但几乎一半的基因编码未表征的蛋白质。同样，由宏基因组学确定的绝大多数噬菌体基因在公共数据库中没有功能分配和同系物（Hurwitz等人，2016; Paez-Espino等人， 2016）。
研究基因的方法之一是通过修饰和随后观察所得到的表型。噬菌体基因组只能在宿主内以其生物活性形式进行修饰。强毒噬菌体严格裂解;因此，它们的基因组从未整合到细菌染色体中。这为DNA的体内修饰增加了一个时间限制，只能在短的感染周期内对其进行操作。 ...
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| Determining the Relative Fitness Score of Mutant Viruses in a Population Using Illumina Paired-end Sequencing and Regression Analysis
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Author:
Date:
2015-05-20
[Abstract] Recent advances in DNA sequencing capacity to accurately quantify the copy number of individual variants in a large and diverse population allows in parallel determination of the phenotypic effects caused by each genetic modification. This systematic profiling approach is a combination of forward and reverse genetics, which we refer to as quantitative high-resolution genetics (qHRG). This protocol describes how to determine the relative fitness score of each variant compared to wild type (WT) virus based on its frequency determined by Illumina sequencing. Random mutagenesis techniques will be ...
[摘要] DNA测序能力的最近进展，准确量化大和多样群体中单个变体的拷贝数允许平行测定由每个遗传修饰引起的表型效应。这种系统分析方法是正向和反向遗传学的组合，我们称之为定量高分辨率遗传学（qHRG）。该方案描述了如何基于其通过Illumina测序确定的频率来确定每个变体与野生型（WT）病毒相比的相对适合度评分。随机诱变技术将用于在目标区域的每个密码子位置引入随机化，从而产生在每个感兴趣位置具有取代的综合输入突变文库（Qi等人，2014; Wu 等人，2014a; Wu ，2014b）。选择后，每个选定的文库将通过Illumina配对末端测序进行测序，并且确定每个突变的频率。基于频率的变化，可以用回归分析计算每个突变体的相对适合度分数。
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