| Live Confocal Imaging of Brachypodium Spikelet Meristems
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Live confocal imaging of fluorescent reporters and stains in plant meristems provides valuable measurements of gene expression, protein dynamics, cell polarity, cell division, and growth. The spikelet meristem in the grass Brachypodium distachyon (Brachypodium) is well suited to live imaging because of the ease of dissection, small meristem size, simple arrangement of organs, and because each plant provides abundant spikelet meristems. Brachypodium is also far easier to genetically transform than other grass species. Presented here is a protocol for the growth, staging, dissection, ...
[摘要] 荧光报告子和植物分生组织中的染色的活共聚焦成像提供了基因表达，蛋白质动力学，细胞极性，细胞分裂和生长的有价值的测量。 由于易于解剖，小分生组织大小，器官的简单排列，并且因为每种植物提供了丰富的小穗分生组织，因此草 Brachypodium distachyon （Brachypodium）中的小穗分生组织非常适合于活体成像。 短柄草比其他草种更容易进行遗传转化。 这里介绍的是用于活体共聚焦成像的短柄草小穗分生组织的生长，分期，解剖，安装和成像的方案。
植物器官（叶子，树枝，花）起源于分生组织，分生组织是含有干细胞群的植物的生长尖端。转录报告子，荧光融合蛋白和荧光染料的活共聚焦成像提供了关于涉及分生组织维持和器官起始的无数基因产物的重要空间和时间信息。 拟南芥花序分生组织的实时成像是一个持续的探索线（Reddy et al。，2004; Bhatia et al。，2016; Prunet et al。，2016; Willis et al。，2016; Landrein et al。，2018; Shi et al。，2018），而拟南芥之外的植物中分生组织的实时成像受到限制（Deb et al。，2015）。
这里展示的是一种共聚物实时成像方案，用于草 Brachypodium distachyon ...
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| A Quantitative Heterokaryon Assay to Measure the Nucleocytoplasmic Shuttling of Proteins
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Many proteins appear exclusively nuclear at steady-state but in fact shuttle continuously back and forth between the nucleus and the cytoplasm. For example, nuclear RNA-binding proteins (RBPs) often accompany mRNAs to the cytoplasm, where they can regulate subcellular localization, translation and/or decay of their cargos before shuttling back to the nucleus. Nucleocytoplasmic shuttling must be tightly regulated, as mislocalization of several RBPs with prion-like domains such as FUS and TDP-43 causes the cytoplasmic accumulation of solid pathological aggregates that have been implicated in ...
[摘要] 许多蛋白质在稳态下仅出现核，但事实上在细胞核和细胞质之间连续地来回穿梭。例如，核RNA结合蛋白（RBP）通常伴随mRNA到达细胞质，在那里它们可以在穿梭回到细胞核之前调节其货物的亚细胞定位，翻译和/或腐烂。必须严格调节核质穿梭，因为几种RBP与朊病毒样结构域如FUS和TDP-43的错误定位导致固体病理性聚集体的细胞质积累，这些聚集体与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆等神经退行性疾病有关。 （FTD）。传统上，种间异核体分析已被用于确定感兴趣的核蛋白是否穿梭;这些分析是基于来自两个不同物种（例如，小鼠和人类）的供体和受体细胞之间的融合，可以根据不同的染色质染色模式区分，并检测蛋白质的外观。受体核。然而，异核体的鉴定需要经验并且容易出错，这使得难以获得用于定量研究的高质量数据。此外，荧光标记的RBP在供体细胞中的瞬时过表达通常导致其异常的亚细胞定位。在这里，我们提出定量测定，其中表达接近生理水平的eGFP标记的RBP的稳定供体细胞系与表达膜标记物CAAX-mCherry的受体细胞融合，允许容易地鉴定和成像大量高可信度异核体。我们的测定法可用于测量任何感兴趣的核蛋白在不同细胞类型，不同细胞条件下或突变蛋白之间的穿梭活性。
【背景】要了解蛋白质的各种功能，重要的是找出它在细胞内定位的位置。标准的微观和生物化学方法仅在其稳态浓度高于检测阈值时才揭示蛋白质的存在。他们不排除它在短暂地定位的情况下扮演其他重要角色的可能性（Gama-Carvalho和Carmo-Fonseca，2001）。例如，许多RBP在不同的细胞区室中发挥作用，它们伴随着它们的结合mRNA（通常未检测到）并连接真核基因表达的多个步骤（Müller-McNicoll和Neugebauer，2013）。 ...
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| Quantification of Extracellular Double-stranded RNA Uptake and Subcellular Localization Using Flow Cytometry and Confocal Microscopy
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Double-stranded RNA is a potent pathogen-associated molecular pattern (PAMP) produced as a by-product of viral replication and a well-known hallmark of viral infection. Viral dsRNAs can be released from infected cells into the extracellular space and internalized by neighboring cells via endocytosis. Mammals possess multiple pattern recognition receptors (PRRs) capable of detecting viral dsRNAs such as endosomal toll-like receptor 3 (TLR3) and cytosolic RIG-I-like receptors (RLRs) which lead to the production of type I interferons (IFNs). Thus, intracellular localization of viral dsRNA can ...
[摘要] 双链RNA是一种有效的病原体相关分子模式（PAMP），作为病毒复制的副产物和病毒感染的众所周知的标志产生。 病毒dsRNA可以从感染的细胞释放到细胞外空间并通过胞吞作用被邻近细胞内化。 哺乳动物具有能够检测导致产生I型干扰素（IFN）的病毒dsRNA（例如内体Toll样受体3（TLR3）和胞质RIG-1样受体（RLR））的多模式识别受体（PRR）。 因此，病毒dsRNA的细胞内定位可以提供对导致先天免疫激活的下游信号传导途径的了解。 在这里，我们描述了一种测量细胞外dsRNA摄取和分别通过流式细胞仪和共聚焦显微镜观察内化dsRNA的亚细胞定位的定量方法。
【背景】双链RNA（dsRNA）是病毒复制的常见副产物，通过产生I型干扰素（IFN）和其他促炎细胞因子（Nellimarla和Mossman，2014）是抗病毒免疫的有效激活剂。病毒的dsRNA通过TLR3核内体内所感测（松本等人，2003年）或在由RIG-I样受体（RLRS），RIG-I和MDA-5（加藤等人，2006）。在裂解感染，这些dsRNA可以被释放到细胞外空间，它们结合于相邻小区，如A类清道夫受体（SR-A）和RAFTLIN表面受体，并且随后经由网格蛋白介导的内吞作用内在化（伊藤制 2008; DeWitte-Orr等人，2010; Watanabe等人，2011; Dansako等人，， ...
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