| Analysis of Autophagic Activity Using ATG8 Lipidation Assay in Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] As a fundamental metabolic pathway to degrade and recycle cellular cargos, autophagy is highly induced upon stress, starvation and senescence conditions in plants. A double-membrane structure named autophagosome will form during this process for cargo sequestration and delivery into the vacuole.
A number of regulators have been characterized in plants, including the autophagy-related (ATG) proteins and other plant-specific proteins. Among them, ATG8 will undergo a lipidation process to become a membrane-bound ATG8-phosphatidylethanolamine form and mark the growing autophagosomal ...
[摘要] 作为降解和回收细胞货物的基本代谢途径，自噬在植物的胁迫，饥饿和衰老条件下被高度诱导。 在这个过程中，将形成一个称为自噬体的双膜结构，用于货物隔离和输送到液泡中。
已经在植物中表征了许多调控因子，包括自噬相关（ATG）蛋白和其他植物特异性蛋白。 其中，ATG8将经历脂化过程以成为膜结合的ATG8-磷脂酰乙醇胺形式并标记日益增长的自噬体膜以及完成的自噬体。 因此，ATG8被认为是自噬体的标志; 并且膜结合形式的ATG8的生物化学检测被用作测量自噬活性的主要方法之一。 在这里，我们描述了使用拟南芥幼苗检测ATG8-PE形式的ATG8脂化测定法。
【背景】自噬是调节受损细胞器的大量降解和不需要的细胞内容物的基本代谢过程。在自噬过程中，称为自噬体的双膜结构将形成并将货物递送到液泡中以降解。自噬相关蛋白（ATG）需要调节自噬活性（Liu and ...
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| Mapping RNA Sequences that Contact Viral Capsid Proteins in Virions
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] We have adapted the methodology of CLIP-seq (Crosslinking-Immunoprecipitation and DNA Sequencing) to map the segments of encapsidated RNAs that contact the protein shells of virions. Results from the protocol report on the RNA sequences that contact the viral capsid.
[摘要] 我们已经调整了CLIP-seq（交联 - 免疫沉淀和DNA测序）的方法来绘制与病毒粒子的蛋白质壳接触的壳化RNA片段。 关于接触病毒衣壳的RNA序列的方案报告的结果。
【背景】正义RNA病毒包括所有生命形式的病原体。具有二十面体形状的病毒具有病毒外壳蛋白在RNA基因组周围形成保护壳（Stockley等人，2013）。在噬菌体MS2和植物感染的Brome花叶病毒（BMV）中，外壳蛋白优先接触特异性RNA序列（Ni等人，2013; Hoover等人。 ，2016; Rolfsson等人，2016）。这些接触可以调节感染期间RNA释放的时间，病毒基因表达和病毒RNA复制（Hoover等人，2016）。鉴定衣壳RNA相互作用可以提供对病毒感染的规定的见解，并提供抑制病毒感染的手段。考虑到这一点，我们已经开发了一种方法，使用UV交联，RNA断裂，外壳蛋白的选择性沉淀和由RNA片段制备的cDNA的下一代测序来鉴定纯化的病毒体中的衣壳RNA接触。以下协议是针对BMV病毒粒子开发的。
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| Protein Isolation from Plasma Membrane, Digestion and Processing for Strong Cation Exchange Fractionation
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Plasma membrane (PM) proteins play crucial roles in diverse biological processes. But their low abundance, alkalinity and hydrophobicity make their isolation a difficult task. This protocol describes an efficient method for PM proteins isolation, digestion and fractionation so that they can be well prepared for mass spectrometry analysis.
[摘要] 血浆膜（PM）蛋白在不同生物过程中起关键作用。但是，他们的低丰度，碱度和疏水性使其隔离成为一项艰巨的任务。该方案描述了PM蛋白分离，消化和分级的有效方法，以便它们可以很好地准备用于质谱分析。
背景 血浆膜（PM）蛋白参与不同的生物学过程，包括信号转导，离子运输和膜运输，是细胞与环境交流中的第一反应者。它们具有从物种，细胞类型和发育阶段变化的复杂组成（Alexandersson等人，2008）。用质谱（MS）全面揭示其组分和表达特征对发育生物学非常重要。然而，它们的疏水性和低丰度对于蛋白质组学分析是一个很大的挑战（Wu和Yates，2003）。通常使用像正常表面活性剂，有机溶剂和尿素这样的添加剂来改善PM蛋白的溶解度，但它们会降低蛋白酶的活性并在MS分析过程中产生离子抑制（Zhang，2015）。 Rapi Gest SF是一种新型酸不稳定的阴离子表面活性剂，其结构和功能上与SDS类似，但不抑制低浓度（0.1％w / v）下的常见内肽酶活性。因此，Rapi 用于增溶PM蛋白的Gest SF不仅可以通过暴露裂解位点促进它们的消化，而且还容易被强酸淬灭并通过离心去除，使表面活性剂不影响MS鉴定（Yu 等人，2003）。通过Rapi Gest ...
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