| Quantification of the Surface Expression of G Protein-coupled Receptors Using Intact Live-cell Radioligand Binding Assays
|
|
Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] G protein-coupled receptors (GPCRs) are the most structurally diverse family of signaling proteins and regulate a variety of cell function. For most GPCRs, the cell surface is their functional destination where they are able to respond a wide range of extracellular stimuli, leading to the activation of intracellular signal transduction cascades. Thus, the quantity of receptor expression at the cell surface is a crucial factor regulating the functionality of the receptors. Over the past decades, many methods have been developed to measure the cell surface expression of GPCRs. Here, we describe ...
[摘要] [摘要] G蛋白偶联受体（GPCR）是信号蛋白中结构最多样化的家族，可调节多种细胞功能。对于大多数GPCR，细胞表面是它们的功能目的地，能够响应广泛的细胞外刺激，从而激活细胞内信号转导级联反应。因此，受体在细胞表面的表达量是调节受体功能的关键因素。在过去的几十年中，已开发出许多方法来测量GPCR的细胞表面表达。在这里，我们描述了完整的活细胞放射性配体结合测定法，以量化内源水平或过表达后GPCR的表面表达。在该测定中，将细胞培养物与特定的细胞不可渗透的放射性配体温育，所述放射性不可配体选择性地和化学计量地结合至各个GPCR，并且通过受体结合的配体的放射性来定量细胞表面的受体数量。 此方法对于测量完整活细胞表面的功能性GPCR具有高度特异性，对于内源性，低丰度的GPCR特别有用。
[背景 ] G蛋白偶联受体（GPCR）构成细胞表面受体的最大超家族，并在生理和病理条件下调节多种细胞功能（Hauser 等人，2017; Hilger 等人，2018; Weinberg和Puthenveedu，2019） ...
|
|
|
| FACS-based Glucose Uptake Assay of Mouse Embryonic Fibroblasts and Breast Cancer Cells Using 2-NBDG Probe
|
|
Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] This is a flow cytometry-based protocol to measure glucose uptake of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and breast cancer cells in vitro. The method is a slightly modified and updated version as previously described (Dong et al., 2017). Briefly, the target cells are incubated with the fluorescently tagged 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) for 2 h or 30 min, and the efficiency of glucose uptake is examined using a flow cytometer. This method can be adapted to measure a variety of adipocytes, immune cells, MEFs and cancer cells.
[摘要] 这是一种基于流式细胞术的方法，用于在体外测量小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和乳腺癌细胞的葡萄糖摄取。 该方法是稍微修改和更新的版本（Dong等人，2017）。 简言之，将靶细胞与荧光标记的2-（N-（7-硝基苯-2-基-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）一起温育2小时或 30分钟，并使用流式细胞仪检查葡萄糖摄取的效率。 该方法可适用于测量各种脂肪细胞，免疫细胞，MEF和癌细胞。
【背景】葡萄糖是细胞的主要能量来源。葡萄糖转运蛋白家族（GLUT）负责跨葡萄糖转运葡萄糖（Kohn等人，1996）。葡萄糖摄取的变化可以反映细胞代谢的变化。例如，肿瘤细胞通常使用葡萄糖进行有氧糖酵解以支持其快速增殖。通常，与正常细胞相比，肿瘤细胞具有增加的葡萄糖摄取速率（Vander Heiden等人，2009）。 2-脱氧葡萄糖（2DG）是一种葡萄糖类似物，它以2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）的形式积累在细胞中。 2DG6P长期以来一直是测量葡萄糖摄取的黄金标准（Yamamoto et al。，2011）。尽管放射性标记的2DG6P的测量是敏感的，但许多研究人员避免了这种方法，因为放射性物质的处理和处置需要特殊的程序。
另一种不可代谢的葡萄糖类似物是荧光标记的2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）。该分子通过葡萄糖转运蛋白积聚在活细胞中，不会进入糖酵解途径。 ...
|
|
|
| Reversible Cryo-arrests of Living Cells to Pause Molecular Movements for High-resolution Imaging
|
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Fluorescence live-cell imaging by single molecule localization microscopy (SMLM) or fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) in principle allows for the spatio-temporal observation of molecular patterns in individual, living cells. However, the dynamics of molecules within cells hamper their precise observation. We present here a detailed protocol for consecutive cycles of reversible cryo-arrest of living cells on a microscope that allows for a precise determination of the evolution of molecular patterns within individual living cells. The usefulness of this approach has been ...
[摘要] 通过单分子定位显微镜（SMLM）或荧光寿命成像显微镜（FLIM）的荧光活细胞成像原理上允许在个体，活细胞中的分子模式的时空观察。然而，细胞内分子的动力学阻碍了它们的精确观察。我们在这里介绍一个详细的方案，用于显微镜上活细胞可逆冷冻停滞的连续循环，允许精确测定各个活细胞内分子模式的演变。通过观察受体酪氨酸激酶的配体诱导的聚集以及SMLM和FLIM的活性模式已经证明了该方法的有用性（Masip等人，2016）。
了解细胞中的分子过程，例如受体 - 酪氨酸激酶（RTK）的配体诱导反应需要精确的时空观察分子模式。由于细胞状态的差异，这种反应需要在个体细胞而不是细胞群体中进行监测（Snijder和Pelkmans，2011）。使用SMLM，各个分子可以以高精度进行定位（Betzig等人，2006）。这允许例如提取关于质膜中的RTK聚类的信息。互补地，共焦FLIM可以揭示分子如何在衍射受限体积元素内作为整体反应。这可以通过使用构象传感器揭示RTK与下游分子的相互作用模式，磷酸化模式以及活性模式（Offterdinger等人，2004; Sabet等人）。 ...
|
|
|