| Design of Hybrid RNA Polymerase III Promoters for Efficient CRISPR-Cas9 Function
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The discovery of the CRISPR-Cas9 system from Streptococcus pyogenes has allowed the development of genome engineering tools in a variety of organisms. A frequent limitation in CRISPR-Cas9 function is adequate expression levels of sgRNA. This protocol provides a strategy to construct hybrid RNA polymerase III (Pol III) promoters that facilitate high expression of sgRNA and improved CRISPR-Cas9 function. We provide selection criteria of Pol III promoters, efficient promoter construction methods, and a sample screening technique to test the efficiency of the hybrid promoters. A hybrid ...
[摘要] 来自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9系统的发现使得在各种生物体中开发基因组工程工具成为可能。 CRISPR-Cas9功能的频繁限制是足够的sgRNA表达水平。 该协议提供了构建杂合RNA聚合酶III（Pol III）启动子的策略，其促进sgRNA的高表达和改善的CRISPR-Cas9功能。 我们提供Pol III启动子的选择标准，有效的启动子构建方法以及样品筛选技术来检测杂合启动子的效率。 为解脂耶氏酵母开发的杂交启动子系统将用作模型。
【背景】CRISPR（成簇定期间隔短回文重复序列）是细菌中发现的DNA序列的集合，其中含有先前曝光的病毒DNA片段（Marraffini和Sontheimer，2010）。片段被称为间隔区DNA，并且它们侧面是短的，重复的回文序列。细菌使用这些存储的间隔序列作为模板来表达RNA，以识别和攻击再次暴露的特定病毒。当与CRISPR相关（Cas）蛋白结合时，CRISPR-Cas系统可以识别和切割外源DNA或RNA，破坏病毒并保护宿主免受重复感染（Barrangou，2013）。
一种特定的CRISPR系统，来自化脓链球菌的II型CRISPR-Cas9已经被修改成用于基因组编辑的更简单的系统。利用这个系统，研究人员能够设计特定的单引导RNA（sgRNA）序列，它与具有上游原型间隔区相邻基序（PAM;'NGG'）的目的基因的20bp序列互补（Jinek ...
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| Polysome Analysis
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Polysome analysis is a method to separate mRNAs from a cell into actively translating and non-translating fractions depending on their association with polysomes. By this protocol, cell lysates are fractionated by sucrose density gradient ultracentrifugation. Free mRNA fraction and various ribosomal fractions, such as 40S, 60S, monosomes and polysomes are collected by fractionation. Association of particular mRNAs with these fractions is detected by reverse transcription – PCR to investigate the translational state of the mRNA.
[摘要] 多聚赖氨酸分析是一种将mRNA从细胞分离为主动翻译和非翻译部分的方法，这取决于它们与多核糖体的关联。通过该方案，通过蔗糖密度梯度超速离心分离细胞裂解物。通过分级收集游离mRNA级分和各种核糖体级分，例如40S，60S，单体和多核糖体。通过逆转录PCR检测特异性mRNA与这些级分的关联，以研究mRNA的翻译状态。
背景 细胞mRNA在任何时间点分布到主动翻译和非翻译池中，并可响应于各种刺激而在这些池之间动态地重新分布。主动翻译的mRNA具有较高数量的与它们相关的核糖体，与mRNA相关的核糖体数量是mRNA的翻译状态的量度。因此，从细胞中分离核糖体时，会在多核糖体组分中发现主要转录的mRNA，而在游离mRNA部分或与40S核糖体亚基相关的非翻译/不良翻译mRNAs。因此，多聚赖氨酸分析是根据其与多核糖体的关联将mRNA从细胞分离为主动翻译和非翻译部分的方法（Ray et al。，2009; Poria等人， >。，2016）。可以通过RT-PCR检测单个mRNA与翻译/非翻译级分的关联，而通过RNA测序或微阵列分析可以鉴定mRNA的整个翻译或非翻译池。
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| Post-crystallization Improvement of RNA Crystals by Synergistic Ion Exchange and Dehydration
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Author:
Date:
2015-09-05
[Abstract] Compared to the recent dramatic growth in the numbers of genome-wide and functional studies of complex non-coding RNAs, mechanistic and structural analyses have lagged behind. A major technical bottleneck in the structural determination of large RNAs and their complexes is preparation of diffracting crystals. Empirically, a vast majority of such RNA crystals fail to diffract X-rays to usable resolution (~4 Å) due to their inherent disorder and non-specific packing within the crystals. Here, we present a protocol that combines post-crystallization cation replacement and dehydration that ...
[摘要] 与最近在复杂的非编码RNA的基因组范围和功能研究的数量的显着增长相比，机械和结构分析已经落后。在大RNA及其复合物的结构确定中的主要技术瓶颈是衍射晶体的制备。经验上，由于其固有的无序和在晶体内的非特异性堆积，绝大多数这样的RNA晶体不能将X射线衍射到可用的分辨率（〜4）。在这里，我们提出一个协议，结合后结晶阳离子替代和脱水，大大改善晶体的大基因调节mRNA-tRNA复杂的衍射质量。该程序不仅将X射线数据的分辨率极限从8.5扩展到3.2，而且还显着提高了数据的质量，实现了重新定相和结构确定。因为它利用了反离子和溶剂化在RNA结构中的一般重要性，这个程序可能证明在其他大型非编码RNA的晶体学分析中广泛有用。
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