| A Quantitative Heterokaryon Assay to Measure the Nucleocytoplasmic Shuttling of Proteins
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Many proteins appear exclusively nuclear at steady-state but in fact shuttle continuously back and forth between the nucleus and the cytoplasm. For example, nuclear RNA-binding proteins (RBPs) often accompany mRNAs to the cytoplasm, where they can regulate subcellular localization, translation and/or decay of their cargos before shuttling back to the nucleus. Nucleocytoplasmic shuttling must be tightly regulated, as mislocalization of several RBPs with prion-like domains such as FUS and TDP-43 causes the cytoplasmic accumulation of solid pathological aggregates that have been implicated in ...
[摘要] 许多蛋白质在稳态下仅出现核，但事实上在细胞核和细胞质之间连续地来回穿梭。例如，核RNA结合蛋白（RBP）通常伴随mRNA到达细胞质，在那里它们可以在穿梭回到细胞核之前调节其货物的亚细胞定位，翻译和/或腐烂。必须严格调节核质穿梭，因为几种RBP与朊病毒样结构域如FUS和TDP-43的错误定位导致固体病理性聚集体的细胞质积累，这些聚集体与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆等神经退行性疾病有关。 （FTD）。传统上，种间异核体分析已被用于确定感兴趣的核蛋白是否穿梭;这些分析是基于来自两个不同物种（例如，小鼠和人类）的供体和受体细胞之间的融合，可以根据不同的染色质染色模式区分，并检测蛋白质的外观。受体核。然而，异核体的鉴定需要经验并且容易出错，这使得难以获得用于定量研究的高质量数据。此外，荧光标记的RBP在供体细胞中的瞬时过表达通常导致其异常的亚细胞定位。在这里，我们提出定量测定，其中表达接近生理水平的eGFP标记的RBP的稳定供体细胞系与表达膜标记物CAAX-mCherry的受体细胞融合，允许容易地鉴定和成像大量高可信度异核体。我们的测定法可用于测量任何感兴趣的核蛋白在不同细胞类型，不同细胞条件下或突变蛋白之间的穿梭活性。
【背景】要了解蛋白质的各种功能，重要的是找出它在细胞内定位的位置。标准的微观和生物化学方法仅在其稳态浓度高于检测阈值时才揭示蛋白质的存在。他们不排除它在短暂地定位的情况下扮演其他重要角色的可能性（Gama-Carvalho和Carmo-Fonseca，2001）。例如，许多RBP在不同的细胞区室中发挥作用，它们伴随着它们的结合mRNA（通常未检测到）并连接真核基因表达的多个步骤（Müller-McNicoll和Neugebauer，2013）。 ...
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| Chick Neural Tube Explant Culture
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Author:
Date:
2015-10-05
[Abstract] The neural tube explant culture technique allows in vitro culturing of small pieces of neural tissue isolated from e.g., chick or mouse embryonic tissue in a matrix of collagen for defined periods of time. This method can be used to study the effects of defined molecules on developmental processes such as neural progenitor proliferation and neuronal differentiation and/or survival. Since the explant material can also be prepared from embryonic tissue electroporated with expression vectors, this technique can be adapted to study gene function in the presence of specific ...
[摘要] 神经管外植体培养技术允许在胶原基质中从例如小鸡或小鼠胚胎组织分离的小片神经组织的体外培养定义的时间段。 该方法可用于研究限定分子对发育过程如神经祖细胞增殖和神经元分化和/或存活的影响。 由于外植体材料也可以从用表达载体电穿孔的胚胎组织制备，该技术可以适于在特定环境信号的存在下研究基因功能。 也可以在解剖步骤期间分离神经管的不同区域，允许单独研究神经管的特定区域。 在这里，我们提出了我们已经在几个研究中使用的神经管外植体培养方法（Dias等人，2014; Lek等人，2010; Vallstedt， et al。，2005）。
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