| Multicolor Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy to Generate High-resolution Images of Respiratory Syncytial Virus Particles and Infected Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Human respiratory syncytial virus (RSV) infection in human lung epithelial A549 cells induces filopodia, cellular protrusions consisting of F-actin, that extend to neighboring uninfected cells (Mehedi et al., 2016). High-resolution imaging via stimulated emission depletion (STED) microscopy revealed filamentous RSV particles along these filopodia, suggesting that filopodia facilitate RSV cell-to-cell spread (Mehedi et al., 2016). In this protocol, we describe how to fix, permeabilize, immunostain, and mount RSV-infected A549 cells for STED imaging. We show that STED ...
[摘要] 人肺上皮A549细胞中的呼吸道合胞病毒（RSV）感染诱导丝状伪足，由F-肌动蛋白组成的细胞突起，延伸至相邻的未感染细胞（Mehedi等，2016）。 通过受激发射耗尽（STED）显微镜的高分辨率成像显示沿着这些丝状伪足的丝状RSV颗粒，表明丝状伪足有助于RSV细胞对细胞的扩散（Mehedi等，2016）。 在本协议中，我们描述如何修复，渗透，免疫染色和挂载RSV感染的A549细胞进行STED成像。 我们显示与共聚焦显微镜相比，STED增加了分辨率，可以通过使用去卷积软件的图像处理进一步改进。
【背景】RSV形成多形性病毒颗粒，其长度大约为直径约100nm，长度大约为10μm（Bachi和Howe，1973; Mehedi等，2016）。高分辨率光学显微技术是可视化RSV感染细胞和病毒颗粒之间相互作用的关键。在最近的一项研究中，我们使用超分辨率荧光显微镜来研究人肺上皮A549细胞中的RSV细胞对细胞的扩散。
STED显微镜是超分辨率显微镜技术之一，已被开发以规避约200nm衍射屏障的光限制（Hell和Wichmann，1994; Westphal等人，2008）。 ...
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| ROS Detection in Botryococcus braunii Colonies with CellROX Green Reagent
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] We analyzed the reactive oxygen species (ROS) accumulation in the colony-forming green microalga Botryococcus braunii in response to several stress inducers such as NaCl, NaHCO3, salicylic acid (SA), methyl jasmonate, and acetic acid. A staining assay using the fluorescent dye CellROX Green was used. CellROX Green is a fluorogenic probe used for measuring oxidative stress in live cells. The dye is weakly fluorescent inside cells in a reduced state but exhibits bright green photostable fluorescence upon oxidation by ROS and subsequent binding to DNA. The large amount of ...
[摘要] 我们分析了响应于几种胁迫诱导剂如NaCl，NaHCO 3，水杨酸（SA），茉莉酸甲酯和乙酸的菌落形成绿色微藻葡萄球菌中的活性氧（ROS）积累。 使用使用荧光染料CellROX Green的染色测定。 CellROX Green是用于测量活细胞氧化应激的荧光探针。 该染料在细胞内处于弱的荧光，但是在通过ROS氧化并随后与DNA结合时呈现出明亮的绿色光稳定荧光。 由布鲁氏杆菌生产和排泄的大量液体烃产生了高度疏水的细胞外环境，使得难以在该微藻上研究短时间的防御反应。 这里开发的程序允许我们在用不同的应激诱导剂处理细胞后，在短时间内（以分钟为单位），在这种微藻中检测ROS。
【背景】用于检测和定量过氧化氢和其他有机氢过氧化物的第一种方法是使用钛（IV）离子（MacNevin和Urone，1953）。由于钛（IV）的完成导致黄色，通过比色法检测过氧化物分子。该方法用于检测内源性过氧化物，并测定两种梨果实中的过氧化氢酶活性与果实成熟相关（Brennan和Frenkel，1977）。检测脂质氢过氧化物的另一种方法是基于硫代巴比妥酸（TBA），并用于测量诸如牛奶等食品的变质（Sidwell等，1955）。虽然该方法不使用有机溶剂，但是需要对酸化浆料进行蒸汽蒸馏来检测氢过氧化物，并且通过分光光度法定量得到的红色。上述方法具有诸如低灵敏度，与其它化合物的干扰以及可能损坏活细胞的溶剂或物质的使用等缺点。开发了一种更灵敏的方法，其中scopoletin（6-甲基-7-羟基-1,2-苯并吡喃酮）的蓝色荧光在其被过氧化物酶氧化后消失（Andreae，1955; ...
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| Quantitative Determination of Poly-β-hydroxybutyrate in Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Cyanobacteria synthesize a variety of chemically-different, high-value biopolymers such as glycogen (polyglucose), poly-β-hydroxybutyrate (PHB), cyanophycin (polyamide of arginine and aspartic acid) and volutin (polyphosphate) under excess conditions. Especially under unbalanced C to N ratios, glycogen and in some cyanobacterial genera also PHB are massively accumulated in the progression of the general nitrogen stress response. Several different technologies have been established for in situ and in vitro PHB analysis from different microbial sources. In this ...
[摘要] 蓝细菌合成各种化学上不同的高价值生物聚合物，如糖原（polyglucose），poly-β-β-羟基丁酸酯（PHB），蓝藻素（精氨酸和天冬氨酸的聚酰胺）和挥发物（多磷酸盐） 在超额条件下。 特别是在不平衡的C至N比下，糖原和一些蓝藻属中，PHB在一般氮应激反应进程中大量积累。 已经针对不同微生物来源的原位实验和/或从体外分析，建立了几种不同的技术。 在该协议中，描述了用于蓝藻（Stechocystis）的PHB定量的快速可靠的分光光度法。 如（Damrow等人，2016）中描述的氮缺乏的PCC 6803。
【背景】非重氮营养蓝细菌，例如集胞藻（Synechocystis） PCC 6803通过漂白来解决缺乏组合的氮源，这是一种被称为褪绿的过程（Allen和Smith，1969）。这种驯化反应的特征在于四个主要的结构和形态变化：（i）类囊体层之间的电子致密糖原夹杂物（直径约40nm）的大量积累伴随着（ii）藻糖酵母天线复合物的降解， （iii）类囊体膜层的拆卸，包括数量减少和包装密度，和（iv）形成不同的电子透明PHB颗粒（直径约400-500nm）（Damrow等人，2016）。由于不存在分解代谢酶和PHB缺陷型突变体的明显表型，所以在几种物种中合成的蓝细菌PHB代谢的生理功能是相当不透明的（Beck等人，2012; van ，2010; Damrow等人，2016; ...
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