| Quantification of Starch in Guard Cells of Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] In this protocol, we describe how to quantify starch in guard cells of Arabidopsis thaliana using the fluorophore propidium iodide and confocal laser scanning microscopy. This simple method enables monitoring, with unprecedented resolution, the dynamics of starch in guard cells.
[摘要] 在该方案中，我们描述了如何使用荧光团碘化丙啶和共聚焦激光扫描显微镜来量化拟南芥保卫细胞中的淀粉。 这种简单的方法能够以前所未有的分辨率监测保卫细胞中淀粉的动态变化。
【背景】淀粉是葡萄糖的复合聚合物，代表植物储存碳水化合物的最丰富形式。淀粉根据其衍生的细胞类型和外部环境条件提供不同的功能。在控制水和二氧化碳与环境交换的气孔中边界的保卫细胞中，淀粉可在转变为光的几分钟内动员，有助于产生有机酸和糖，从而增加保卫细胞膨胀并促进气孔开放。在叶肉细胞中，淀粉通常在白天逐渐积累，并在夜间降解以支持代谢（Santelia和Lunn，2017）。
因为保卫细胞仅占总叶的一小部分，所以难以使用常规方法定量测量淀粉。到目前为止，保卫细胞中的淀粉积累主要通过碘染色显现。该技术可以确定淀粉的存在/不存在，但不能提供准确的定量信息。
在这里，我们描述了一种基于荧光的成像方法来量化拟南芥保护细胞中的淀粉。该技术基于细胞壁材料和其他葡聚糖底物（包括淀粉）与荧光假席夫试剂碘化丙啶（PS-PI）的共价标记。用高碘酸处理分离的表皮，以将葡萄糖单元的羟基氧化成醛和酮基团。然后醛基（-CHO）可以与碘化丙锭共价反应，产生具有高荧光葡聚糖的样品，非常适合于共聚焦激光扫描显微镜。保卫细胞叶绿体中单个淀粉颗粒的面积可以使用数字成像来确定。我们应用这种方法来评估完整的拟南芥叶片的保护细胞中的淀粉含量在昼夜循环中的动态变化，并确定fusicoccin（质子泵的化学活化剂）对淀粉量的影响。分离表皮的保卫细胞剥离漂浮在气孔开放缓冲液中的碎片（Horrer ...
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| TUNEL Assay to Assess Extent of DNA Fragmentation and Programmed Cell Death in Root Cells under Various Stress Conditions
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Date:
2017-08-20
[Abstract] DNA damage is one of the common consequences of exposure to various stress conditions. Different methods have been developed to accurately assess DNA damage and fragmentation in cells and tissues exposed to different stress agents. However, owing to the presence of firm cellulosic cell wall and phenolics, plant cells and tissues are not easily amenable to be subjected to these assays. Here, we describe an optimized TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) assay-based protocol to determine the extent of DNA fragmentation and programmed cell death in plant ...
[摘要] DNA损伤是暴露于各种压力条件的常见后果之一。 已经开发了不同的方法来准确评估暴露于不同应激剂的细胞和组织中的DNA损伤和碎裂。 然而，由于纤维素细胞壁和酚类物质的存在，植物细胞和组织不容易进行这些测定。 在这里，我们描述了优化的TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口标记）测定方法，以确定经受各种应激条件的植物根细胞中DNA片段化和程序性细胞死亡的程度。 这里描述的方法具有简单，可靠和重复性好的优点。
【背景】暴露于各种压力通常导致至少一定程度的DNA损伤，导致各种损伤，例如胸腺嘧啶二聚化，碱基烷基化，单链缺口和双链断裂（Bray和West，2005; Manova和Gruszka，2015）。在所有类型的DNA损伤中，DNA片段化在应激条件下特别令人关注，这可能是应激的直接影响（如用基因毒素治疗方法所观察到的）或间接作用（主要是通过过度产生的活性氧），甚至可能是两者的累积结果（Bray和West，2005; Kapoor等，2015）。这种DNA损伤必须由细胞的修复机械精确修复，否则可能会导致细胞死亡。为了维持正常状态，细胞利用依赖于三个非排他事件的DNA损伤反应。检测/识别损坏，其通过维修机械的访问，最后修复（Smerdon，1991）。
在细胞水平上应力适应的主要分子机制之一涉及对由于应激引起的受损DNA的DNA损伤和/或有效修复的抗性。因此，为了评估基因型的应激适应性，通常需要对DNA损伤进行准确评估。两种广泛用于检测植物DNA断裂的测定法是单细胞凝胶电泳 ...
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| Efficient Isolation of Influenza Specific CTLs
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Author:
Date:
2016-06-20
[Abstract] Human antigen-specific CD8+ T-cell clones are valuable tools for dissecting CD8+ T-cell responses against antigens derived from infectious agents, cancer and self antigens. Here we describe a protocol for isolating human antigen-specific CD8+ T cells. This protocol uses surface capture of IFNγ to identify antigen responsive cells that are then cloned by single-cell sorting. Here we use CD8+ T-cell responses to influenza matrix protein (MP) as an example, but this approach can be applied to any antigen specificity.
[摘要] 人抗原特异性CD8 + T细胞克隆是用于解剖来自感染剂，癌症和自身抗原的抗原的CD8 + T细胞应答的有价值的工具。 在这里我们描述了用于分离人抗原特异性CD8 + T细胞的方案。 该协议使用IFNγ的表面捕获来鉴定抗原反应性细胞，然后通过单细胞分选克隆。 这里我们使用CD8 + T细胞对流感基质蛋白（MP）的反应作为例子，但这种方法可以应用于任何抗原特异性。
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