| Nuclear/Cytoplasmic Fractionation of Proteins from Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] C. elegans is widely used to investigate biological processes related to health and disease. To study protein localization, fluorescently-tagged proteins can be used in vivo or immunohistochemistry can be performed in whole worms. Here, we describe a technique to localize a protein of interest at a subcellular level in C. elegans lysates, which can give insight into the location, function and/or toxicity of proteins.
[摘要] ℃。 线虫>广泛用于研究与健康和疾病相关的生物过程。 为了研究蛋白质定位，荧光标记的蛋白质可用于体内>或免疫组织化学可在整个蠕虫中进行。 在这里，我们描述了一种在 C中亚细胞水平定位感兴趣的蛋白质的技术。 线虫>裂解物，可以洞察蛋白质的位置，功能和/或毒性。
【背景】亚细胞分级已用于不同的模式生物中以鉴定和研究细胞核，细胞膜和细胞质中的蛋白质功能。 例如，当聚集倾向蛋白定位于细胞核或细胞质中时，它们的毒性可能更大（Kontopoulos et al。>，2006; Barmada et al。>，2010）。 在这里，我们提供了一个协议（改编自Chen et al。>，2000和La Rocca et al。>，2007）来定位的细胞核和细胞质组分中的特定蛋白质。>℃。线虫>。
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| Filter Retardation Assay for Detecting and Quantifying Polyglutamine Aggregates Using Caenorhabditis elegans Lysates
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Protein aggregation is a hallmark of several neurodegenerative diseases and is associated with impaired protein homeostasis. This imbalance is caused by the loss of the protein’s native conformation, which ultimately results in its aggregation or abnormal localization within the cell. Using a C. elegans model of polyglutamine diseases, we describe in detail the filter retardation assay, a method that captures protein aggregates in a cellulose acetate membrane and allows its detection and quantification by immunoblotting.
[摘要] 蛋白质聚集是几种神经退行性疾病的标志，并且与蛋白质体内平衡受损有关。 这种不平衡是由蛋白质天然构象的丧失引起的，最终导致其在细胞内聚集或异常定位。 使用 C。 线虫聚谷氨酰胺疾病模型，我们详细描述了过滤阻滞测定，一种捕获醋酸纤维素膜中蛋白质聚集体的方法，并允许通过免疫印迹进行检测和定量。
【背景】帕金森氏症，阿尔茨海默氏症和多聚谷氨酰胺疾病等神经退行性疾病的一个病理特征是在大脑不同区域存在蛋白质聚集物（Soto，2003; Stroo et al。，2017）。在多谷氨酰胺疾病的情况下，编码序列中谷氨酰胺（CAG）重复的异常扩增扰乱了蛋白质的天然折叠。结果，错误折叠的蛋白质暴露其氨基酸序列的区域，这使得它易于与其他蛋白质聚集，形成大的，不溶的聚集体，这可能妨碍正常的细胞功能（综述于Kuiper 等人 ，2017）。
已经开发了几种用于检测不溶性蛋白质聚集体的方法，包括例如染料结合测定（例如，硫磺素T，刚果红，NIAD-4）和电子显微镜检查。过滤阻滞测定是一种快速而灵敏的方法，可检测和定量体内和体外形成的蛋白质聚集体，包括聚谷氨酰胺（Scherzinger et al。 ，1997; Wanker et al。，1999），α-突触核蛋白（Recasens et al。，2018），和amyloid-beta聚集体（Bieschke et ...
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| In vitro Nitrate Reductase Activity Assay from Arabidopsis Crude Extracts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Nitrate reductase (NR) reduces the major plant nitrogen source, NO3-, into NO2-. NR activity can be measured by its final product, nitrite through its absorbance under optimized condition. Here, we present a detailed protocol for measuring relative enzyme activity of NR from Arabidopsis crude extracts. This protocol offers simple procedure and data analysis to compare NR activity of multiple samples.
[摘要] 硝酸还原酶（NR）将主要的植物氮源NO 3 N-2还原为NO 2 - 2。 NR活性可以通过其最终产物，亚硝酸盐在最佳条件下通过其吸光度来测量。 在这里，我们提供了一个详细的协议，用于测量来自拟南芥粗提物的NR的相对酶活性。 该协议提供简单的程序和数据分析来比较多个样品的NR活性。
【背景】氮是植物所需的主要营养素，主要以硝酸盐的形式吸收。硝酸还原酶是高等植物中首次同化氮的酶。植物硝酸还原酶的同型二聚体如下催化硝酸根的NAD（P）H依赖性还原为亚硝酸根：
NO <3> + NADH + H +→NO - + NAD + H 测量NR活性的方法可能是研究影响NR活性的生物因素的有力工具（Park等人，2011）。氮同化影响植物中氨基酸的含量，因此调节NR活性可用于提高某些作物的质量（Croy和Hageman，1970; Dalling和Loyn，1977; Ruan等人，1998） ）。在该协议中，在优化的缓冲液条件下限制时间内亚硝酸盐浓度增加作为可比值获得。亚硫酸盐浓度通过Griess测定法通过其在540nm处的吸光度来测量。简言之，亚硝酸盐与磺胺酸形成重氮盐，然后N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐形成有色偶氮化合物。可以比较这些值以确定样品如何具有不同的NR活性。此外，通过简单的过程可以将这些数值转换为精确增加的亚硝酸盐浓度。 ...
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