| Generation of Mutant Pigs by Direct Pronuclear Microinjection of CRISPR/Cas9 Plasmid Vectors
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] A set of Cas9 and single guide CRISPR RNA expression vectors was constructed. Only a very simple procedure was needed to prepare specific single-guide RNA expression vectors with high target accuracy. Since the de novo zygotic transcription had been detected in mouse embryo at the 1-cell stage, the plasmid DNA vectors encoding Cas9 and GGTA1 gene specific single-guide RNAs were micro-injected into zygotic pronuclei to confirm such phenomenon in 1-cell pig embryo. Our results demonstrated that mutations caused by these CRISPR/Cas9 plasmids occurred before and at the 2-cell stage of ...
[摘要] 构建了一套Cas9和单引导CRISPR RNA表达载体。 需要一个非常简单的程序来制备具有高目标精度的特异性单向RNA表达载体。 由于在1细胞期的小鼠胚胎中已经检测到了合并的合子转录，所以将编码Cas9和GGTA1基因特异性单向RNA的质粒DNA载体微注射到合子原核中以确认 1细胞猪胚胎现象。 我们的研究结果表明，这些CRISPR / Cas9质粒引起的突变发生在猪胚胎的2细胞阶段之前和之后，表明除了体外转录的RNA的细胞质显微注射外，CRISPR / Cas9 DNA载体为产生基因敲除猪提供了有效的解决方案。
背景 由于最初发现了大肠杆菌基因组（Ishino）中的大肠杆菌基因组下游的32bp间隔的串联重复的高度保守的29个碱基对（bp）序列，等等，1987; Nakata等人，1989），在约50％至50bp的大小变化的短定期间隔重复序列的家族中发现约50％细菌和90％的古细菌（Makarova等人，2015）。根据它们的特征结构，Mojica（Mojica等人，2009）和Jansen（Jansen等人）引入了定期交织的短回文重复序列（CRISPR）的名称， ，2002），目前普遍使用。首先通过核苷酸序列比对（Jansen等人，2002）在CRISPR基因座的侧翼首先鉴定了一组CRISPR相关基因 cas1 ...
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| Transfection of Human Naive CD4+ T Cells with PHA Activation and Neon Electroporation
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Author:
Date:
2013-08-05
[Abstract] Transfection of primary T cells can be challenging. This protocol describes a method to transfect primary human naive CD4+ T cells with an AP-1 luciferase reporter using low-level activation by phytohemagglutinin (PHA) and electroporation, as published (Palin et al., 2013). This technique is a modification of one previously described by our group (Cron et al., 2013). Anyone wishing to transfect murine T cells should consult the publication by Cron et al., 2013. This technique may be adapted for other primary T cell types by optimizing the Neon ...
[摘要] 原代T细胞的转染可能是具有挑战性的。 该方案描述了使用植物凝集素（PHA）和电穿孔的低水平激活，用AP-1荧光素酶报道子转染初级人初始CD4 + T细胞的方法，如公开的（Palin等人 。，2013）。 这种技术是先前由我们组描述的技术的修改（Cron等人，2013）。 任何希望转染鼠T细胞的人都应参考Cron等人2013年的出版物。该技术可以通过优化氖电穿孔条件来适应其它原代T细胞类型，如文中所述。 可以使用其他荧光素酶或GFP报道分子，并且将需要优化该特定报道分子的刺激条件。
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