| Rolling Circle Amplification to Screen Yam Germplasm for Badnavirus Infections and to Amplify and Characterise Novel Badnavirus Genomes
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Since the first discovery of badnaviruses (family Caulimoviridae, genus Badnavirus) in yam (Dioscorea spp.) germplasm in the 1970s (Harrison and Roberts, 1973), several hundred partial badnavirus reverse transcriptase (RT)-ribonuclease H (RNaseH) sequences have been characterised (Kenyon et al., 2008; Bousalem et al., 2009), but only a few complete Dioscorea bacilliform virus (DBV) genome sequences have been reported (Phillips et al., 1999; Seal and Muller, 2007; Bömer et al., 2016 and 2017; Sukal et al., 2017; ...
[摘要] 自二十世纪七十年代山药（Dioscorea spp。）种质中首次发现坏病毒属（家庭花椰菜科，属于病毒属）之后（Harrison和Roberts， 1973），已经表征了数百个部分坏死病毒逆转录酶（RT） - 核糖核酸酶H（RNaseH）序列（Kenyon等人，2008; Bousalem等人，2009年），但仅有少数几种完整的Dioscorea杆状病毒（DBV）基因组序列已被报道（Phillips等，1999; Seal和Muller，2007;Bömer等， 2016和2017; Sukal等人，2017; Umber等人，2017）。我们优化了总核酸提取和滚环扩增（RCA）结合限制性酶分析的工作流程，以检测和扩增山药种质中存在的DBV。我们已经使用这种方法成功地揭示了三种新型附加体阴性坏死病毒（Bömer等人，2016年）。我们提出这是变性梯度凝胶电泳的补充方法，其能够快速指示坏死病毒多样性以及在宿主基因组中鉴定潜在整合的坏死病毒序列（Turaki等人，2017年） ）。在这里，我们描述了一步一步的方案来筛选山药种质的坏死病毒感染使用RCA作为一个有效的研究工具，在扩增和表征的新型坏死病毒基因组。
【背景】RCA是经常用于扩增环状DNA病毒基因组的序列无关的策略（Rector等人，2004）。 Phi29聚合酶介导的RCA技术用于（i）检测新型病毒; ...
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| Chromatin Affinity Purification (ChAP) from Arabidopsis thaliana Rosette Leaves Using in vivo Biotinylation System
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Chromatin Affinity Purification (ChAP) is widely used to study chromatin architecture and protein complexes interacting with DNA. Here we present an efficient method for ChAP from Arabidopsis thaliana rosette leaves, in which in vivo biotinylation system is used. The chromatin is digested by Micrococcal Nuclease (MNase), hence the distribution of nucleosomes is also achieved. The in vivo biotinylation system was initially developed for Drosophila melanogaster (Mito et al., 2005), but the presented protocol has been developed specifically for Arabidopsis ...
[摘要] 染色质亲和纯化（ChAP）被广泛用于研究染色质结构和与DNA相互作用的蛋白质复合物。 在这里，我们提出了一种有效的从拟南芥莲座叶中ChAP的方法，其中使用了体内生物素化系统。 染色质被Micrococcal核酸酶（MNase）消化，因此核小体的分布也被实现。 体内生物素化系统最初是为黑腹果蝇而开发的（Mito et al。2005），但是所提出的方案是专门为 拟南芥（Sura et。，2017）。
【背景】染色质免疫沉淀（ChIP）成为研究染色质结构和组织的最重要和最常用的技术之一。但是，它需要高质量的抗体，不会与非特异性靶标发生交叉反应。在含有细胞壁并富含光合作用相关化合物和蛋白质的植物中，这是相当难以实现的，这些化合物和蛋白质经常引起交叉反应性问题。另一方面，获得稳定的转基因生物是植物常规和容易的策略。由于这些原因，大多数植物研究人员选择基因标签，获得融合蛋白，并用ChIP替代方法即染色质亲和纯化（ChAP）来研究染色质。 ChAP技术已被证明在植物染色质研究中非常有效（Zentner和Henikoff，2014）。此外，它通常比经典ChIP便宜，因为它不需要产生抗体，并且通常比ChIP更有效，因为标签以比直接针对感兴趣的蛋白质产生的抗体更高的亲和力被识别。 ...
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| Measurement of RNA-induced PKR Activation in vitro
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Protein kinase R (PKR) is one of the key RNA-activated sensors for innate immunity. PKR is activated by pathogenic or aberrant RNAs such as short double-stranded RNAs or those with imperfect secondary structures, as well as a reduction in the amount and number of RNA modifications. Activation of PKR may be an underlying mechanism for the pathogenesis of human diseases. In this protocol, I describe a method for studying levels of RNA-induced PKR activation in vitro.
[摘要] 蛋白激酶R（PKR）是先天免疫的核心RNA激活传感器之一。 PKR由致病性或异常RNA如短双链RNA或具有不完全二级结构的RNA激活，以及RNA修饰的量和数量的减少。 PKR的激活可能是人类疾病发病机制的潜在机制。在本协议中，我描述了一种在体外研究RNA诱导的PKR激活水平的方法。
背景 PKR是四种哺乳动物激酶之一，其响应于应激信号磷酸化真核起始因子2-α亚基（eIF2α）。 PKR主要是响应于病毒感染而激活（Holcik和Sonenberg，2005）。 PKR是识别和结合病原RNA的先天免疫的关键组成部分。 RNA与PKR的相互作用促进并稳定其二聚化。然后PKR经历自身磷酸化，随后磷酸化eIF2α以切断一般翻译，同时激活下游信号级联，包括增加的ATF4应激反应转录因子的翻译（Hinnebusch，2005）。
＆nbsp;已知PKR被短双链RNA激活（Manche等人，1992; Zheng和Bevilacqua，2004）以及具有一些不完全二级结构的RNA，例如发夹环（Bevilacqua 等人，1998）。此外，RNA生物发生缺陷，包括较低水平的m ...
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