| Generation of Luciferase-expressing Tumor Cell Lines
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Murine tumor models have been critical to advances in our knowledge of tumor physiology and for the development of effective tumor therapies. Essential to these studies is the ability to both track tumor development and quantify tumor burden in vivo. For this purpose, the introduction of genes that confer tumors with bioluminescent properties has been a critical advance for oncologic studies in rodents. Methods of introducing bioluminescent genes, such as firefly luciferase, by viral transduction has allowed for the production of tumor cell lines that can be followed in vivo ...
[摘要] 鼠肿瘤模型对于我们对肿瘤生理学知识和有效肿瘤治疗方法发展的进展至关重要。 这些研究的关键是能够跟踪肿瘤发展并量化体内肿瘤负荷。 为此，引入赋予肿瘤生物发光特性的基因已经成为啮齿动物肿瘤研究的重要进展。 通过病毒转导引入生物发光基因（例如萤火虫萤光素酶）的方法已经允许产生可以在体内纵向长时间地进行的肿瘤细胞系。 在这里我们描述了通过慢病毒转导产生稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞系的方法。
【背景】体内跟踪细胞最重要的是能够通过微创方法从外部检测它们。使用来自萤火虫的荧光素酶（Photinus pyralis ）的酶促生物发光是用于体内基于图像的细胞追踪的广泛使用的方法。生物发光已被用于各种体内应用，包括报告基因表达的无创成像（Herschman，2004），研究昼夜节律（Southern and Millar，2005），成像脑卒中（Vandeputte
萤火虫荧光素酶氧化物萤光素在分子氧，镁和三磷酸腺苷存在下在560nm产生黄绿色光（Wilson和Hastings，1998; ...
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| Isolation, BODIPY Labeling and Uptake of Exosomes in Hepatic Stellate Cells
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Exosomes have emerged as an important mediator of intercellular communication. They are present in extracellular milieu and therefore, easily accessible by neighboring or distant cells. They carry mRNA, microRNAs and proteins within their vesicles and once internalized by recipient cells; they can modulate multiple signaling pathways with pleiotropic effects from inducing antiviral state to disease progression. We have previously shown that hepatitis C virus (HCV) infected hepatocytes or hepatoma cells harboring genome-length replicon secrete exosomes in culture supernatants. These exosomes ...
[摘要] 外来体已经成为细胞间通讯的重要介质。 它们存在于细胞外环境中，因此可以被邻近或远处的细胞轻易获得。 它们在囊泡内携带mRNA，microRNA和蛋白质，并一度被受体细胞内化; 它们可以通过诱导抗病毒状态向疾病进展调节多种信号传导途径，具有多效性。 我们以前已经显示，携带基因组长度复制子的丙型肝炎病毒（HCV）感染的肝细胞或肝癌细胞在培养上清液中分泌外泌体。 这些外来体被肝星状细胞（HSC）摄取，并在HCV感染期间激活它们以诱导纤维化。 在这里，我们描述了外来体分离和肝星状细胞摄取BODIPY标记的外来体的详细的协议。
【背景】外来体是直径为40-150nm的小的膜结合的细胞外囊泡。已在所有体液中鉴定出它们，包括尿，羊水，血清，唾液，母乳，脑脊液，鼻分泌物和组织培养的细胞系的上清液中。外泌体通过转移微小RNA（mRNA），mRNA和蛋白质来介导细胞与细胞之间的通讯。 其可被邻近或远处的细胞摄取，并随后促进受体细胞中的信号传导（Schorey等人，2015）。外泌体富含蛋白质，包括四跨膜蛋白家族成员（CD9，CD81，CD63），热休克蛋白（Hsp60，Hsp70，Hsp90）和多泡体蛋白（annexins，RabGTPases和内体分选复合物，蛋白质）。最近的研究表明，外来体可以影响免疫应答（Li等人，2013; ...
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| Accurate, Streamlined Analysis of mRNA Translation by Sucrose Gradient Fractionation
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] The efficiency with which proteins are produced from mRNA molecules can vary widely across transcripts, cell types, and cellular states. Methods that accurately assay the translational efficiency of mRNAs are critical to gaining a mechanistic understanding of post-transcriptional gene regulation. One way to measure translational efficiency is to determine the number of ribosomes associated with an mRNA molecule, normalized to the length of the coding sequence. The primary method for this analysis of individual mRNAs is sucrose gradient fractionation, which physically separates mRNAs based on ...
[摘要] 从mRNA分子产生蛋白质的效率可以在转录本，细胞类型和细胞状态之间广泛变化。准确测定mRNA翻译效率的方法对获得对转录后基因调控的机理理解至关重要。测量翻译效率的一种方法是确定与mRNA分子相关的核糖体的数目，归一化为编码序列的长度。分析单个mRNA的主要方法是蔗糖梯度分级，其基于结合核糖体的数目物理分离mRNA。在这里，我们描述了精确分析与核糖体的mRNA相关性的简化方案。与以前的方案相比，我们的方法结合内部控制和改进的缓冲条件，共同减少由非特异性mRNA - 核糖体相互作用引起的伪像。此外，我们的直接分数qRT-PCR方案消除了从梯度部分中RNA纯化的需要，这大大减少了所需的手动时间量，并促进了多个条件或基因靶标的并行分析。此外，在该过程中不产生苯酚废物。我们最初开发了协议来研究S-HAC1 mRNA的翻译抑制状态。但是我们还详细介绍了哺乳动物细胞系和组织的适应程序。
【背景】将mRNA翻译成蛋白质是一种高度调节的过程，其可以以不同的速率发生，这取决于基因，细胞环境或环境。翻译起始，延伸和终止的每个步骤可以是最终影响与mRNA相关的核糖体数量的调节点（Dever和Green，2012; ...
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