| Investigating Localization of Chimeric Transporter Proteins within Chloroplasts of Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] In this protocol, we describe a method to design chimeric proteins for specific targeting to the inner envelope membrane (IEM) of Arabidopsis chloroplasts and the confirmation of their localization by biochemical analysis. Specific targeting to the chloroplast IEM can be achieved by fusing the protein of interest with a transit peptide and an IEM targeting signal. This protocol makes it possible to investigate the localization of chimeric proteins in chloroplasts using a small number of transgenic plants by using a modified method of chloroplast isolation and fractionation. IEM ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述了一种设计嵌合蛋白的方法，用于特异性靶向拟南芥叶绿体的内包膜（IEM）并通过生化分析确定它们的定位。 叶绿体IEM的特异性靶向可通过将感兴趣的蛋白质与转运肽和IEM靶向信号融合来实现。 这个协议使得有可能使用少量的转基因植物，通过使用修改的叶绿体分离和分离方法来研究嵌合蛋白在叶绿体中的定位。 嵌合蛋白的IEM定位可以通过胰蛋白酶消化和碱性提取进一步评估。 在此，称为SbtAII的嵌合碳酸氢根转运蛋白的定位通过使用针对葡萄球菌蛋白A的抗体进行蛋白质印迹来检测。该方案改编自上原等人，2016年
【背景】有人提出将蓝藻CO 2浓度机制整合到叶绿体中是改善C 3+植物光合作用的有希望的方法。 根据理论估计，将BicA和SbtA整合到叶绿体IEM中可以提高光合CO 2固定率。 我们研究了核编码的蓝细菌碳酸氢盐转运蛋白BicA和SbtA与拟南芥叶绿体的IEM的整合。 因此，我们制定了一个协议，设计嵌合构造为特定目标的IEM和调查嵌合蛋白在叶绿体中的定位。
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| MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis
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Author:
Date:
2014-06-20
[Abstract] This protocol is an example of how to analyse suspected interactions between proteins using a pull-down assay (Sauer et al., 2013). A bait protein of interest (in this case, MTV1 of Arabidopsis thaliana) is fused to a GST tag and expressed in bacteria. The protein is isolated and allowed to bind to a matrix of glutathione-conjugated agarose beads via the GST-tag. Unspecifically binding proteins from the bacterial lysate are removed from the matrix. A native plant protein extract is then passed over the matrix and binding between the bait GST-MTV1 and prey proteins can occur. ...
[摘要] 该方案是如何使用下拉测定分析蛋白质之间可疑相互作用的实例（Sauer等人，2013）。 感兴趣的诱饵蛋白（在这种情况下，为拟南芥的MTV1）与GST标签融合并在细菌中表达。 分离蛋白质并使其通过GST标签结合到谷胱甘肽缀合的琼脂糖珠的基质上。 从基质中除去来自细菌裂解物的非特异性结合蛋白。 然后将天然植物蛋白提取物通过基质，并且可以发生诱饵GST-MTV1和猎物蛋白之间的结合。 大量洗涤去除非特异性结合的蛋白质，最后，诱饵和猎物蛋白质从珠子中释放。 然后使用免疫印迹分析来鉴定与GST-MTV1结合的蛋白质。 重要的是，平行地分析由GST标记单独组成的阴性对照，以排除猎物蛋白结合到GST-MTV1诱饵是由于GST标记的可能性。
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